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RAPD法鉴定番茄杂种纯度及番茄WO和TM-2基因RAPD标记的研究

高蓝  
【摘要】: 番茄作为一种模式植物,在生理生化、遗传及分子生物学等方面的研究广泛而深入。我国是番茄生产大国,为了确保种子的真实性和纯度,保护农业生产和农民的合法权益,必须发展快速准确的品种鉴定方法。影响番茄F1代杂交种子纯度的主要因素是母本自交产生的种子的混杂。目前用RAPD法检测番茄种子纯度时仍是用幼苗期叶片DNA进行的,为尽量缩短种子的检验时间,发展从单粒干种子中提取DNA进行RAPD检验的方法将很有应用前景。 近年来随着番茄分子遗传图谱的日益完善及许多重要农艺性状和形态性状的被标记和定位,为彻底了解番茄的遗传机制奠定了基础。番茄的多毛性状WO是一种优良的抗虫性状,该性状目前还未建立分子标记,通过建立WO性状的DNA分子标记有助于了解该性状纯合致死的原因和番茄毛状体发生发育的机制及对该性状的开发利用。Tm-2基因是番茄抗TMV的重要基因,它与nv(网纹转绿)性状紧密连锁,尚未发现Tm-2与nv之间的重组现象。该基因目前已有多个RAPD标记,但Tm-2基因尚未分离出来,继续寻找该基因的分子标记将有助于了解Tm-2这个重要的抗病性状位点的基因结构。 本文建立了从番茄干种子中提取DNA的方法;优化建立了番茄的RAPD反应体系;建立了可用于鉴定番茄 F1代杂种毛粉808、毛粉818和强选1号品种纯度的RAPD标记;以干种子为材料鉴定了强选1号的品种纯度;建立了可将毛粉808、毛粉818、强选1号、毛粉802和西粉3号5个番茄品种进行分组鉴别的RAPD标记;进行了寻找WO基因的RAPD标记的研究;克隆并测定了三个RAPD标记的序列,其中S1072683为品种纯度鉴定的标记,S13161057为品种分组鉴别的标记,S1388952为Tm-2 (nv)位点的标记;建立了与Tm-2 (nv)位点紧密连锁的RAPD标记S178570 和S1388952。 按改良的杨崇林的方法从叶片中提取DNA。进行RAPD引物筛选的模板为毛粉808的父本(tm-2 NV wo/wo)和母本(Tm-2 nv WO/wo)。产生父本特异多态性DNA片段的RAPD引物被用于品种纯度的鉴定;产生母本特异多态性DNA片段的RAPD引物有可能产生Tm-2(nv)或WO位点的RAPD标记。 350条10碱基的随机引物用于RAPD标记的筛选。共产生了3590条扩增片段(10.3条片段/引物),片段大小为0.1-3.5kb。得到在毛粉808的父本和母本间产生多态性的引物12条(3.43%),多态性扩增产物14条(0.39%)。其中6个RAPD标记可用于鉴定毛粉808、毛粉818和强选1号的品种纯度,它们是:S1019400, S14221270, S16950, S1503750, S1072683 和S1388800;另外8个母本特异的RAPD标记是:S5051700, S1458650, S169570, S66780, S178570, S1388952, S66740 和S13161057;2个RAPD标记S66740 和 S13161057可将5个番茄品种分为2组,一组为毛粉808、毛粉WP=7818和毛粉802,一组为强选1号和西粉3号。RAPD标记S1072683, S13161057 和 S1388952以pMD18-T载体进行克隆,重组质粒以XbaⅠ/SalⅠ双酶切和以引物S1072, S1316 and S1388分别扩增相应的重组质粒的方法进行检验。测序后的分析表明三个序列中的S13161057可能是编码蛋白质的核酸序列。接着标记S1072683被用于鉴定强选1号的品种纯度。 强选1号的品种纯度鉴定使用从番茄干种子中提取的DNA进行。提取种子DNA的方法与提取叶片DNA的方法相似。共检测100粒种子,67粒种子获得扩增产物,其中2粒没有S1072683特异带,即为假杂种。这个结果与形态学鉴定结果相符(69棵植株中有2棵假杂种)。试验表明用RAPD法检测品种纯度快速、实用、可靠,随着技术的进一步完善,在番茄的F1代杂种的纯度鉴定工作中可以作为形态学鉴定方法的替代方法。 依据S1072683的核酸序列,计划将这个RAPD标记转化为SCAR标记。设计合成了2对引物(引物长20碱基),对毛粉808的亲本进行PCR扩增反应,反应混合物的组成及热循环参数与RAPD扩增反应相似,变动处在2个引物的含量及热循环参数中的退火温度。扩增结果在毛粉808的父本中得到了预期大小的扩增产物,但在毛粉808的母本中也得到了相同的扩增产物,原因有待进一步研究。 在经过350条RAPD随机引物的筛选及依据在拟南芥毛状体的发生与发育中起重要作用的GL1基因的序列和在番茄根毛中优势表达的类伸展蛋白基因Dif-10基因的序列而合成的二对各10碱基的特选引物的筛选工作后仍未能发现与WO基因相关的RAPD标记,反映GL1基因和Dif10基因与WO基因可能没有关联,番茄毛状体的发生发育的调控过程有另外的机制有待揭示。 构建了毛粉808的F2 群体(139株)和毛粉818的F2 群体(39株),进行了RAPD标记S13161057, S178570和S1388952与Tm-2 (nv)位点的连锁分析(参照Ohmori的方法通过nv性状建立Tm-2基因的RAPD标记)。RAPD标记与Tm-2 (nv)位点的遗传距离用Mapmaker 3.0软件计算。对毛粉808和毛粉818F2群体的连锁分析表明RAPD标记13161057在两个群体中均产生了严重的偏向父本的偏分离,对造成偏分离的原因还不清楚。RAPD标记S178570 和S1388952 在两个群体中均显示与Tm-2(nv)位点紧密连锁,并分列在该位点的两侧。初步计算的结果是,在毛粉808群体中,S178570 和S1388952与Tm-2(nv)位点的遗传距离分别为0.1cM 和3.6cM;在毛粉818群体中,S178570 和S1388952与Tm-2(nv)位点的遗?


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