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蚕豆保卫细胞ABA、H_2O_2信号转导系统的研究

张骁  
【摘要】: 保卫细胞ABA信号转导是生命科学研究的热点之一。迄今为止较为完善的气孔保卫细胞信号转导的模式由Assmann (1993)提出,该模式列举了人们已取得共识的信号成分和转导途径,除此之外是否还存在其他新的信号成分及转导途径,仍是人们不断探索的问题。本实验在表皮生物分析的基础上,主要利用显微注射技术、膜片钳技术和激光共聚焦显微技术,研究ABA诱导蚕豆气孔保卫细胞H2O2的产生及其信号转导途径。 表皮生物分析显示,H2O2可抑制气孔开放和促进气孔关闭。低浓度的H2O2所诱导的气孔运动具有一定的可逆性,抗坏血酸(AsA)即维生素C(Vc)可部分逆转低浓度H2O2(≤10-5M)所诱导的气孔关闭过程;而且外源过氧化氢酶(CAT, H2O2的清除剂)和DPI(NADPH氧化酶的抑制剂)也可部分逆转外源ABA所诱导的气孔关闭过程。采用H2O2荧光探针乙酰乙酸盐-2,7-二氯氢化荧光素(H2DCFDA)标记蚕豆气孔保卫细胞,激光扫描共聚焦显微镜光切扫描观察外源ABA诱导蚕豆保卫细胞内H2O2的变化。结果表明,随ABA浓度的升高,保卫细胞的荧光急剧增加;时间进程实验显示,胞内叶绿体部位的荧光增加明显超前其它胞质区域;CAT和DPI可在一定程度上抑制ABA所诱导的保卫细胞中的H2O2产生。另外,内源ABA(通过显微注射)也可诱导保卫细胞产生H2O2,进而促进气孔关闭,这些效应同样可通过显微注射CAT或DPI被部分逆转。这些结果表明H2O2可能是ABA信号转导链的一个中间成分,ABA至少有胞内和胞外两个作用位点。 本实验用两步酶解法分离蚕豆叶片气孔保卫细胞原生质体,利用膜片钳(patch clamp)研究了ABA和H2O2对保卫细胞质膜内向K+通道的影响。研究结果表明:培养液中含有1.0 ?M ABA,保卫细胞的质膜内向K+电流可被抑制76%(在-190 mV);但胞内含有100 U mL-1 CAT或10 ?M DPI可部分逆转ABA抑制的质膜内向K+电流;与ABA类似,培养液中含有10-5M H2O2同样可显著抑制质膜内向K+电流,胞内抗坏血酸(即维生素C,Vc)几乎可完全逆转H2O2抑制的质膜内向K+电流。这些结果表明H2O2抑制的质膜内向K+通道可能参与了ABA诱导的气孔运动过程。 苯甲胺(一种能通过细胞膜的弱碱)和H2O2均能诱导气孔关闭;丁酸(一种能通过细胞膜的弱酸)则可部分逆转H2O2诱导的气孔关闭过程。应用pH敏感的探针SNARF-1-AM标记蚕豆气孔保卫细胞,利用激光共聚焦显微技术对胞内pH动态变化检测表明:H2O2可诱导保卫细胞胞质碱化、液胞酸化;而丁酸预处理可显著逆转上述变化。这些结果暗示,H2O2刺激可导致胞质中的质子经液胞膜上的H+-ATPase流向液胞而造成胞质碱化,胞质碱化可能是H2O2诱导气孔关闭的早期信号之一。


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