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牛卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植

李雪峰  
【摘要】: 1.本研究比较了不同类型血清、不同来源的激素以及大卵泡液对牛卵母细胞体外成熟的影响。 在无大卵泡液存在时,成熟培养液中添加发情牛血清(OCS)和胎牛血清(FBS),卵母细胞的体 外成熟率显著高于添加新生牛血清(NCS)时的成熟率(83.1%,82.9%比53.0%,P<0.01);在培 养液中添加3%大滤泡液(BFF)时,OCS和FBS内卵母细胞的成熟率明显高于NCS内的成 熟率(85.1%,83.5%比57.7%,P<0.01)。结果表明:本实验条件下,OCS和FBS可以显著提 高卵母细胞的成熟率,而NCS不适合于牛卵母细胞的体外成熟;BFF添加与否不影响卵母 细胞的成熟率。在培养液中添加低纯度的FSH(10μg/ml)和LH(20μg/ml)或高纯度的 HMG(含0.075U/ml FSH+0.075U/ml LH)对牛卵母细胞体外成熟无显著的差异。 2.比较了几种不同的化学激活方法对牛卵母细胞激活的影响,为体细胞核移植胚胎的激活确立 激活条件。选择明显具有第一极体的成熟卵母细胞,随机分为以下9组:(1).Ionomycin(I)+ DMAP(D)(ID);(2).I+D+CCB(C)(IDC);(3).I+CHX(X)(IX);(4).I+X+C(IXC);(5).7%乙醇(E)+ D(ED);(6).E+D+C(EDC);(7).E+X(EX);(8).E+X+C(EXC);(9).Sr~(2+)+C(SC)。Ionomycin和7% 乙醇处理时间为5min;DMAP±CCB处理时间为4h;放线菌酮(CHX)±CCB处理时间 为5h;Sr~(2+)+CCB处理时间为10h。体外培养24h后,前8组卵裂率在53.0%-64.6%间,大 多无明显差异,但均明显高于SC组的卵裂率(30.1%);培养36h后,各组的卵裂率分别为 72.0%、75.5%、81.3%、85.1%、81.7%、82.4%、74.4%、78.1和%51.0%;IX、IXC、ED、 EDC组卵母细胞的卵裂率明显高于ID、IDC、EX组,SC组显著低于其它各组,表明在10mM Sr~(2+)+CCB内培养10h不能有效地激活牛卵母细胞。培养到第8天时,各组的囊胚发育率分 别为18.2%、24.5%、7.2%、11.9%、11.1%、19.4%、6.7%、12.2%和2.0%,ID、IDC和EDC 组内囊胚发育率显著高于IX、IXC、ED、EX、EXC和SC组。结果表明Ionomycin与DMAP ±CCB以及7%乙醇与DMAP+CCB结合使用可以有效地激活牛卵母细胞。Ionomycin对牛 卵母细胞的激活作用比乙醇强烈;而6-DMAP的激活效果比CHX的激活效果好,激活液中 CCB的存在对孤雌生殖胚胎的发育有利。在0.2mM DMAP内培养的卵母细胞,囊胚发育率 低于2mM DMAP内培养的卵母细胞,表明低浓度的6-DMAP不能充分激活牛卵母细胞。 3.体外成熟的牛卵母细胞经5μM Ionomycin内5min和2mM 6-DMAP+5μg/ml CCB内4h 激活后,分别在TALP+M199(1∶2)(TM)、BMOC+M199(1∶2)(BM)和CR1aa内培养,24h 和36h后各组间卵裂率无显著差异;培养8天后囊胚发育率分别为18.2%、21.4%和 29.3%。孤雌激活卵母细胞在CR1aa内的囊胚发育率显著高于TM内的发育率(P<0.01), 但与BM内的孤雌激活卵母细胞间无明显差异。结果表明CR1aa和BM较适合孤雌激活 卵母细胞的体外培养,培养液中添加EGF和ICF对孤雌激活卵母细胞的卵裂和体外发育 无明显影响。Hoechst 33342染色和UV照射对孤雌卵母细胞的卵裂和体外发育产生负面 的影响,且对卵母细胞的卵裂影响尤为明显。 牛卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植 一 4.利用常规的组织培养技术,建立了3头良种奶、肉牛耳缘皮肤成纤维细胞的传代细胞,为体 细胞核移植提供了充足的供体细胞。用含8%DMSO的血清作冷冻液,采用简化的细胞冷冻 方法冷冻保存了皮肤成纤维细胞。 5.通过电融合法或细胞质内注射法将供体细胞核移入体外成熟22~23 h去核的卵母细胞内, 重组胚经 Ionomycin和 6-DMAP(或加 CCB)激活后,转入不同的培养系统内进行培养。以牛 皮肤成纤维细胞为核供体细胞,比较融合法和细胞质内注射法进行核移植的差异,结果融合 法构建重组胚的效率显著低于细胞质内注射法;重组胚培养36 h后卵裂率相同,培养8天 后囊胚发育率无显著差异;但相对于操作的卵母细胞总数而言,前者得到的囊胚发育率显著 低于后者,表明用细胞质内注射法进行体细胞核移植效率更高。采用细胞质内注射法进行核 移植,卵丘细胞作供体时,显微操作后卵母细胞的存活率显著低于皮肤成纤维细胞做供体时 的存活率(刀.5%比87.o%);重组胚培养36 h后,前者的卵裂率显著高于后者(77.8%比7O.8%, 卜0.05):两种类型的供体细胞所构建的重组胚的囊胚发育率无显著差异(16.5%比11.9叨。 研究发现来自不同个体的皮肤成纤维细胞所构建的重组胚,卵裂率和囊胚发育率无差异。 6.应用细胞质内注射法和lonomycin与6-DMAPteCB协同激活法进行核移植,卵丘细胞作供 体时,BMM+MI99(BM)内培养的重组胚,24 h和 36h的卵裂率显著高于 TALP+M199(TM) 内培养的重组胚(58.0%比39.8o:78.6%比55.6%,


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