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鲑鱼降钙素基因植物表达载体的构建及遗传转化研究

赵吉强  
【摘要】:降钙素(Calcitonin,CT)在临床上主要用于治疗骨质增生、各种原因引起的骨骼疼痛症状、Paget'S疾病、高钙血症等。现临床应用的主要是从鲑鱼鳃和猪甲状腺分离纯化的降钙素,来源有限,价格昂贵。尽管研究者已在原核细胞表达系统对鲑鱼降钙素的表达进行了研究,但由于原核表达系统缺乏翻译后的加工修饰等缺点,限制了其应用。因此,利用植物表达系统大规模生产降钙素,满足社会对降钙素日益增长的需求,具有重要的实际意义。本研究旨在由鲑鱼降钙素(sCT)基因的链霉菌表达载体构建sCT基因的植物表达载体;并将sCT基因转入生菜等作物,使其成为降钙素的新型生物反应器,为降钙素的生产提供一条经济有效的新途径。主要研究结果如下: 1. 通过限制性内切酶BamHI/HindIII酶切sCT基因的链霉菌表达质粒pMS680获得sCT基因,并将其克隆至植物表达载体pART27,获得sCT基因的植物表达载体pART27-sCT,并通过电击转化法成功转化土壤根癌农杆菌C58。 2. 通过基因枪微弹射入法将sCT基因导入胡萝卜愈伤组织;酶联免疫法检测sCT蛋白的瞬时表达情况,结果表明sCT基因能够在胡萝卜愈伤组织中表达。 3. 通过研究不同激素浓度对大速生散叶生菜子叶外植体再生的影响,确定其适宜的诱芽培养基为:MS+0.1mg/L6-BA+0.05mg/LNAA,生菜子叶外植体的再生率为60.3%;抗生素敏感性试验表明,适宜的Km选择压为75mg/L,Carb的浓度为300mg/L。 4. 通过农杆菌介导的叶盘法,将sCT基因转入烟草及生菜,经在含75mg/LKm的诱芽培养基和1/2MS生根培养基筛选,获得Km抗性烟草40株,生菜118株;经PCR检测,得到转基因烟草11株,转基因生菜29株。


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