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小鼠胚胎干细胞多能性研究

李相运  
【摘要】:本研究以小鼠为实验材料,在成功分离小鼠ES细胞的基础上,从不同角度对ES细胞的多能性进行鉴定,主要内容包括: (1)小鼠ES细胞的分离与克隆 以第2至第5代经丝裂霉素C处理4hrs的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)作为饲养层,利用高糖DMEM作为基础培养基,同时添加15%的新生犊牛血清、0.1mm的2—巯基乙醇、1%的非必需氨基酸、2mM的谷氨酰胺和青、链霉素各50UI/ml,从535例C57BL/6小鼠囊胚内细胞团分离获得15个类ES细胞系,ES细胞集落边缘清楚,表面光滑,结构致密,隆起生长,呈鸟巢状,细胞之间界线不清楚,消化成单细胞后可见细胞小而园。AKP染色呈阳性,核型正常。在体外分化实验中,ES细胞可分化形成上皮样细胞、内胚层样细胞、外胚层样细胞、肌肉样细胞等,也可聚集生长形成囊状胚。 (2)小鼠ES细胞与四倍体胚胎嵌合 国内首次采用四倍体胚胎与ES细胞共培养聚合法制备嵌合体,采用80V/mm电场强度和50μsec脉冲时程从1074枚2细胞胚胎得到387枚4细胞融合胚胎,将它们与ES细胞共培养聚合后得到248枚四倍体嵌合胚胎,移植24只假孕母鼠,10只妊娠,其中3只在妊娠的第18天剖腹,得到7只畸形死胎,其余7只没有产仔。虽然没有得到有生活力的个体,但结果说明本研究分离的C57BL/6小鼠ES细胞具有多能性,能分化形成机体的多种组织。嵌合体获得率很低,这可能与四倍体胚胎的质量以及不适当的ES细胞整合数量有关。同时还发现,四倍体胚胎在MEF饲养层上也可形成囊胚,并贴壁形成ICM样细胞集落,但这些集落继续培养后并不分化增殖,而是空泡化死亡:KSOM是小鼠2细胞胚胎适宜的培养液。 (3)小鼠ES细胞去核 首次对ES细胞进行去核研究,结果发现:在细胞松弛素B的作用下,通过Ficoll密度梯度离心法可有效去除小鼠ES细胞的细胞核,但所得去核ES细胞的生活力不会超过48hrs。细胞松弛素B的浓度、离心速度、离心时间及孵育时间分别以20μg/ml、25000rpm、50mins和60~90mins为宜。 (4)小鼠去核ES细胞与胎儿成纤维细胞核的融合 采用玻璃片培养离心法可使75%的成纤维细胞发生去核作用,成纤维细胞核与无核ES细胞在PEG(聚乙二醇)的作用下可重新构建成有活力的杂种细胞,但该杂种细胞是否具有ES细胞的特性还有待进一步证实。


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