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波形纤维蛋白对大鼠前体脂肪细胞分化的调控

田志华  
【摘要】: 本研究首先采用SD大鼠脂肪组织的基质血管细胞(stromal vascular cells,SV cells)成功地进行了脂肪细胞培养,探讨脂肪细胞培养体系的建立方法及其细胞生物学特性。在此基础上应用选择性系列抽提结合整装电镜标本技术、免疫组织化学和间接免疫荧光技术、原位杂交技术、SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹技术(Western blotting),观察和比较在大鼠前体脂肪细胞分化过程中,前体脂肪细胞和成熟的脂肪细胞中间纤维(Intermediate filament,IF)的类型及在胞内分布特点的差异及其对前体脂肪细胞增殖和分化的调控;同时采用单细胞显微注射技术和间接免疫荧光技术,在前体脂肪细胞分化早期把抗波形纤维蛋白单抗注射入前体脂肪细胞,观察其对脂肪细胞生成的影响。本研究旨在为进一步阐明前体脂肪细胞分化过程中波形纤维蛋白调节的分子机制奠定基础,为体脂过量沉积的调控提供一条新思路。本研究主要作了以下几方面的工作: 1 体外培养的大鼠前体脂肪细胞分化的生物学特性 目的:研究大鼠脂肪细胞的原代培养条件及其增殖、分化的生物学特性,比较两种原代细胞培养法(组织培养和消化培养)培养脂肪细胞的优缺点。方法:采用两种原代细胞培养法(组织培养和消化培养)培养脂肪细胞。脂肪组织取材于20日龄雄性SD大鼠的肾周围、附睾、腹股沟。消化培养法中前体脂肪细胞由胶原蛋白酶Ⅰ型消化脂肪组织后获得,接种密度为5×10~4个细胞/cm~2,培养液采用M199+10%FCS+胰岛素(50 nM),37℃,5%CO_2(体积分数),90%—95%饱和度,培养时间10天。细胞分化程度的鉴定采用油红0染色(定性)和总脂含量、甘油三酯含量、GPDH测定(定量)。并采用MTT法检测不同浓度胰岛素(0 nM、50nM和100 nM)对细胞分化的诱导作用。对脂肪细胞进行传代,检测其是否是终末分化细胞。结果:(1)、组织培养法中1-3周后可见少量组织块的边缘游离出细胞,一个月左右分化出成熟脂肪细胞,组织块接种成活率为12%:而消化法中,细胞分化完全只需10天左右。前体脂肪细胞的倍增时间和贴壁率分别为:59.75h、39.1%。(2)、随着分化的进行,细胞发生形态学和生理学变化。分化的第1天和第2天,没有脂滴出现,细胞中脂肪含量、TG值和GPDH活性为0。第三天开始出现脂滴,到第10天成熟脂肪细胞TG值比第3天前体脂肪细胞高12倍,差异极显著(P<O.01),GPDH活性达到318IU/mg,与第5天相比增加了4倍多,且脂肪细胞占总细胞数的比例为86.8±2.3%。(3)、前体脂肪细胞的生长具有明显的胰岛素依赖性。在无胰岛素的培养液中生长缓慢,并且与含50nmol/L或100nmol/L胰岛素培养基中细胞增长速度差异极显著(P<0.01),但50nmol/L和100nmol/L胰岛素培养基中细胞生长状态却差异不显著(P>0.05)。(4)原代培养6-7天的脂肪细胞传代后细胞多为不规则多角形或梭形,不容易贴壁,脂滴数量减少或消失,增殖减缓,不易形成单层汇合。结论:(1)、酶消化法培养脂肪细胞的效果比组织块贴壁法更为理想:细胞提纯程度高,更易贴壁,生长迅速,获得的脂肪细胞数多,且所含脂滴多,不足之处需要大量昂贵的胶原蛋白酶I型;而组织块培养法需要时间长,各细胞成分混杂。(2)、前体脂肪细胞向脂肪细胞分化过程中细胞的变化规律是:①前体脂肪细胞的增殖主要在前体脂肪细胞分化的早期(2-6天),表现为细胞数目大量增加;6天之后,则主要是细胞的肥大作用,表现 为细胞体积增大,胞内总脂肪含量、甘油三酯含量增加,GPDH酶活性增大;②细胞形态变化明 显,从扁平宽梭形或不规则三角形到充满大小不一脂滴的不规则椭圆形;③GPDH基因的表达滞 后于脂质物-甘油三酯的形成。(3)、前体脂肪细胞的生长具有明显的胰岛素依赖性。(4)、 SD大鼠脂肪组织的SV细胞属于典型的前体脂肪细胞,可作为脂肪细胞的体外培养模型。(5)、 脂肪细胞属终末分化细胞。 2 前体脂肪细胞分化中中间纤维类型、分布和表达及其对脂肪细胞形成的影响 目的:研究前体脂肪细胞分化过程中中间纤维的类型、分布和表达规律;检测细胞形态学的 变化,探讨波形纤维蛋白对前体脂肪细胞分化的影响。方法:采用免疫组化HRP法和原位杂交 技术,对前体脂肪细胞分化中波形纤维蛋白的表达进行定性和定量检测,并用彩色图像分析系 统对其细胞形态参数值(等效直径、细胞总面积、周长、胞核面积及核质比)进行分析;应用 整装电镜制作技术结合选择性抽提方法、间接免疫荧光技术及考马斯亮蓝R250染色技术观察前 体脂肪细胞和脂肪细胞中间纤维网络的分布构像;采用SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白印迹分析检测 中间纤维蛋白的分子量;采用光镜、透射电镜。激光扫描共焦显微镜进行观察和分析。结果: 门)、波形纤维蛋白不仅存在于前体脂肪细胞分化的整个过程,而且随分化的进行,其灰度值增 大,蛋白表达量呈下降趋势,染色模式为细胞质,分子量为57KD,其mRNA的表达模式与蛋白表 达模式基本一致。(2)、抗波形纤维蛋白单克隆抗体的间接兔疫荧光标记证实前体脂肪细胞和脂 肪细胞中存在精细且清晰的波形纤维中间纤维网络。在前体脂肪细胞分化过程中,波形纤维在 胞质的分布和形态结构发生变化:从在前体


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