药用多肽基因植物表达载体的构建及其对胡萝卜和番茄的遗传转化

【摘要】： 根据胸腺肽基因的序列设计引物，同时设计上酶切位点，用EcoRI和BamHI酶切目的基因和pART7质粒载体，构建成pART7—THY中间载体，用NotI酶切pART7—THY中间裁体和pART27质粒载休，构建成pART27—THY植物表达载体。通过电击法将pART27—THY植物表达载体转入根癌农杆菌C58，并用含有植物表达载体pART27—THY的C58根癌农杆菌侵染“新透心红”胡萝卜和“美味樱桃”番茄。 侵染的“美味樱桃”番茄子叶外植体在MS+2.0mg/L ZT+0.05mg/L IAA培养基上头得到34棵卡那抗性株，用CTAB法提取DNA进行PCR检测，有4株为阳性，刚性株率为11.8％。用CTAB大量提取法提取PCR阳性株的DNA，进行Southern杂交，有1棵植株为阳性，用异硫氰酸胍法提取该植株的RNA，进行RT—PCR检测，结果在转录水平上有表达。 侵染后的“新透心红”胡萝卡下胚轴在B5+1.0mg/L NAA+0.5mg/L。BA培养基上出芽很慢，共得到87株卡那抗性株，经PCR检测有14株为职性，阳性株率为16.1％，其中形态异常的有3棵，占阳性株的21.4％。在14株阳性株中，有1株先期抽薹开花，不久就死亡。对移栽成活的3株PCR阳性植株做Southern杂交，3株全为阳性株，其中1株有一个拷贝，另2株为3个拷贝。提取这3株的RNA做RT—PCR检测，单拷贝的植株在转录水平上没有表达，另2株都有转录。 将侵染后的胡萝卜下胚接于B5+0.1mg/L 2，4-D和MS+0.1mg/L 2，4-D培养基上培养，4周后将B5+0.1mg/L 2，4-D上的外植体转移到B5(处理①)和MS(处理②)培养基上，将MS+0.1mg/L 2，4-D上的外植体转移到B5(处理③)和MS(处理④)培养基上继续培养，4周后统计结果表明，处理③和④产生胚状体，处理①和②直接生芽，处理③成苗率最高，处理④成勒率最低，且有的芽愈伤化；处理③上产生的胚只有及时转移到MS培养基上，才能长成形态正常的小植株。 提取pART27—CT表达载体的质粒，并加以纯化，用基因枪将降钙素基因导入用MS+0.1mg/L 2，4-D诱导的“新透心红”胡萝卜愈伤组织中，转化后接于MS+0.1mg/L BA培养基上诱导生芽。共得到16棵卡那抗性株，PCR检测阳性株为13棵，阳性株率为81.25％。由于形成串联重复，阳性株所扩增出的目的片段比阳性对照要大。PCR阳性株移栽后仅4株成活，经叶片提取DNA进行Southern杂交，其中3株为阳性株，所得的3个小的肉质根，经PCR检测有2个为刚性，对这2个肉质根做PCR-Southern杂交，均为阳性，对其中较大的肉质根做Southern杂交，也为阳性，但做Northern杂交未检测到阳性。有一棵植株虽然开了花，但花粉败育，未得到种子。 PRIB和PBI121质粒用SacI利SmaI双酶切，构建成PRIBG。pART7用XhaI进行完全酶切，PRIBG 川 Sacl进行完个酶切，分w川 K［enow Fragment补平，进行江接，构议成卜7lBG。P7lBG川Smal 完全酶切，江接构建成I‘7G。I’7lBG川 NOtl进行不完全酶切，回收最人片段，pAHT27－1”HY和 pART27｛T 川 NOtl完全酶切，【l叫父。卜片段并分别与 P71BG的问收产物相江，得P7lBG－TilY禾11 P7lBG－CT。P7G川 NOtl 进行不完全酶tjJ，1ill收的人片段，PART27－THY和 PARI”27－CT ）h NOtl完个酶iD，问收小片段并分别与 P7G的问收产物什I壮，得P7G－1”IIYfll P7G－CT。这就将GUS报告基冈、PRIB分泌基冈与胸腺肽或降钙素 口的基冈构建刮－个上达载体卜，形成了多元表达载体。通过基冈枪法川多几农达载体转化叭箩卜愈 伤织织，但木能得利柏株。对转化愈伤组织进行South。rn拙交，结果为川性，川X－Glue对愈伤组织 进行染色，愈们纠织变忱。