收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

药用多肽基因植物表达载体的构建及其对胡萝卜和番茄的遗传转化

张丽华  
【摘要】: 根据胸腺肽基因的序列设计引物,同时设计上酶切位点,用EcoRI和BamHI酶切目的基因和pART7质粒载体,构建成pART7—THY中间载体,用NotI酶切pART7—THY中间裁体和pART27质粒载休,构建成pART27—THY植物表达载体。通过电击法将pART27—THY植物表达载体转入根癌农杆菌C58,并用含有植物表达载体pART27—THY的C58根癌农杆菌侵染“新透心红”胡萝卜和“美味樱桃”番茄。 侵染的“美味樱桃”番茄子叶外植体在MS+2.0mg/L ZT+0.05mg/L IAA培养基上头得到34棵卡那抗性株,用CTAB法提取DNA进行PCR检测,有4株为阳性,刚性株率为11.8%。用CTAB大量提取法提取PCR阳性株的DNA,进行Southern杂交,有1棵植株为阳性,用异硫氰酸胍法提取该植株的RNA,进行RT—PCR检测,结果在转录水平上有表达。 侵染后的“新透心红”胡萝卡下胚轴在B5+1.0mg/L NAA+0.5mg/L。BA培养基上出芽很慢,共得到87株卡那抗性株,经PCR检测有14株为职性,阳性株率为16.1%,其中形态异常的有3棵,占阳性株的21.4%。在14株阳性株中,有1株先期抽薹开花,不久就死亡。对移栽成活的3株PCR阳性植株做Southern杂交,3株全为阳性株,其中1株有一个拷贝,另2株为3个拷贝。提取这3株的RNA做RT—PCR检测,单拷贝的植株在转录水平上没有表达,另2株都有转录。 将侵染后的胡萝卜下胚接于B5+0.1mg/L 2,4-D和MS+0.1mg/L 2,4-D培养基上培养,4周后将B5+0.1mg/L 2,4-D上的外植体转移到B5(处理①)和MS(处理②)培养基上,将MS+0.1mg/L 2,4-D上的外植体转移到B5(处理③)和MS(处理④)培养基上继续培养,4周后统计结果表明,处理③和④产生胚状体,处理①和②直接生芽,处理③成苗率最高,处理④成勒率最低,且有的芽愈伤化;处理③上产生的胚只有及时转移到MS培养基上,才能长成形态正常的小植株。 提取pART27—CT表达载体的质粒,并加以纯化,用基因枪将降钙素基因导入用MS+0.1mg/L 2,4-D诱导的“新透心红”胡萝卜愈伤组织中,转化后接于MS+0.1mg/L BA培养基上诱导生芽。共得到16棵卡那抗性株,PCR检测阳性株为13棵,阳性株率为81.25%。由于形成串联重复,阳性株所扩增出的目的片段比阳性对照要大。PCR阳性株移栽后仅4株成活,经叶片提取DNA进行Southern杂交,其中3株为阳性株,所得的3个小的肉质根,经PCR检测有2个为刚性,对这2个肉质根做PCR-Southern杂交,均为阳性,对其中较大的肉质根做Southern杂交,也为阳性,但做Northern杂交未检测到阳性。有一棵植株虽然开了花,但花粉败育,未得到种子。 PRIB和PBI121质粒用SacI利SmaI双酶切,构建成PRIBG。pART7用XhaI进行完全酶切,PRIBG 川 Sacl进行完个酶切,分w川 K[enow Fragment补平,进行江接,构议成卜7lBG。P7lBG川Smal 完全酶切,江接构建成I‘7G。I’7lBG川 NOtl进行不完全酶切,回收最人片段,pAHT27-1”HY和 pART27{T 川 NOtl完全酶切,【l叫父。卜片段并分别与 P71BG的问收产物相江,得P7lBG-TilY禾11 P7lBG-CT。P7G川 NOtl 进行不完全酶tjJ,1ill收的人片段,PART27-THY和 PARI”27-CT )h NOtl完个酶iD,问收小片段并分别与 P7G的问收产物什I壮,得P7G-1”IIYfll P7G-CT。这就将GUS报告基冈、PRIB分泌基冈与胸腺肽或降钙素 口的基冈构建刮-个上达载体卜,形成了多元表达载体。通过基冈枪法川多几农达载体转化叭箩卜愈 伤织织,但木能得利柏株。对转化愈伤组织进行South。rn拙交,结果为川性,川X-Glue对愈伤组织 进行染色,愈们纠织变忱。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 任清;刘光杰;郭秀林;沈世华;;PpDREB2基因植物表达载体的构建[J];华北农学报;2006年02期
2 王文秀;顾节清;陈德坤;邓文;潘丽;王宝琴;王永录;张永光;;转亚洲Ⅱ型口蹄疫病毒VP1基因烟草研究[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2007年01期
3 黄东杰;张树珍;冯翠莲;顾丽红;范海阔;;无机焦磷酸化酶基因的克隆与植物表达载体的构建[J];热带作物学报;2007年02期
4 蓝海燕,田颖川,张丽华,刘桂珍,王兰岚,陈正华;烟草β-1,3-葡聚糖酶cDNA克隆、大肠杆菌表达及植物表达载体的构建[J];生物工程学报;1998年04期
5 张竞秋,邢燕平,哈斯阿古拉;苜蓿花叶病毒复制酶基因全长cDNA植物表达载体的构建和对烟草的转化[J];内蒙古大学学报(自然科学版);2004年04期
6 任雪艳,陈创夫,孔庆军,高剑锋,祝建波;大肠杆菌菌毛抗原K88与热稳定肠毒素ST融合基因植物表达载体的构建及其在烟草中的初步表达[J];石河子大学学报(自然科学版);2005年01期
7 李伟;陈晓阳;杜金友;高琼;;PttGA20ox1基因在转化烟草植株中的表达[J];西北植物学报;2006年01期
8 郝岗平;张友灿;苗苗;王健美;李艳玲;;广范围高效的植物乙型肝炎病毒表面抗原表达载体构建及鉴定[J];泰山医学院学报;2006年06期
9 刘显军;刘忠松;;RNAi研究及在植物中的应用[J];作物研究;2006年05期
10 王静毅;朱道圩;;猕猴桃果实特异表达异戊烯基转移酶基因植物表达载体的构建[J];安徽农业科学;2007年16期
11 周波;孙梅;阎淑滑;李玉花;;隐花色素CRY2基因片段克隆及RNAi植物表达载体的构建[J];分子植物育种;2008年06期
12 吴杨;贺俐;;PMI基因为筛选标记的抗旱表达载体构建[J];井冈山大学学报(自然科学版);2010年02期
13 石东乔,周奕华,张丽华,刘桂珍,陈正华;油菜BcNA1启动子与拟南芥Fad2基因的克隆及相关植物表达载体的构建[J];云南大学学报(自然科学版);1999年S3期
14 张治礼,郑学勤;异戊烯基转移酶基因(ipt基因)的克隆、序列分析及植物表达载体的构建[J];热带作物学报;2001年04期
15 王永飞,马三梅,张鲁刚,王鸣,郑学勤;细胞质雄性不育相关基因orf224的克隆及其植物表达载体的构建[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2002年04期
16 黄胤怡,沈明山,陈亮,熊玲媛,陈睦传;查尔酮合酶基因的克隆及双元载体的构建[J];厦门大学学报(自然科学版);2002年05期
17 祁瑜;贺竹梅;郑诺燕;徐茵;;以提高乙肝病毒表面抗原表达量和免疫原性为目的的番茄果实特异表达载体的构建[J];中山大学学报(自然科学版);2005年06期
18 赵明敏;赵健;郭永清;李国俊;;RNA干扰及其在植物研究中的应用[J];中国农学通报;2006年04期
19 邵敏;周鹤峰;葛正龙;;人白介素-12植物表达载体的构建[J];第四军医大学学报;2007年10期
20 张红心;杨晓坡;苏勇波;陈亮;;OsCHX1基因克隆及转基因植株获得[J];厦门大学学报(自然科学版);2008年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王春台;;一个新的烟草糖基转移酶的初步研究[A];中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编(2004-2008)[C];2008年
2 田爱梅;曹家树;;白菜雄性不育相关基因BcMF15启动子的克隆、序列分析及植物表达载体的构建[A];中国园艺学会十届二次理事会暨学术研讨会论文摘要集[C];2007年
3 郝建江;刘望夷;谢伟军;黄骏麒;龚蓁蓁;;抗真菌蛋白(AFP)基因转化棉花和烟草的研究[A];植物分子育种——第四届全国植物分子育种学术研讨会论文集[C];2004年
4 林炳英;李梅;;乙肝表面抗原基因植物表达载体的构建[A];2006中国植物细胞发育与分子生物学学术研讨会论文集[C];2006年
5 陈红漫;祝令香;董志扬;;酿酒酵母海藻糖-6-磷酸合成酶基因克隆及植物表达载体的构建[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展(上册)[C];2001年
6 高水平;范丙友;刘改秀;史国安;李嘉珏;孔祥生;;牡丹ACS反义基因植物表达载体的构建[A];中国观赏园艺研究进展(2010)[C];2010年
7 罗齐军;朱昌叁;周鹏;曾富华;;Rs-AFP2基因植物表达载体的构建及其转化辣椒的研究[A];2005年全国植物逆境生理与分子生物学研讨会论文摘要汇编[C];2005年
8 胡根海;喻树迅;范述丽;宋美珍;王清连;付远志;;陆地棉叶绿体超氧化物歧化酶基因的克隆与植物表达载体的构建[A];中国棉花学会2007年年会论文汇编[C];2007年
9 周庆丰;曹永长;毕英佐;;传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年
10 谢会;张春荣;陈云凤;黄霞;黄学林;;苜蓿TPP基因cDNA全长序列的克隆及植物表达载体的构建[A];全国“植物生物技术及其产业化”研讨会论文摘要集[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 冷华妮;植物栓塞修复机制与质膜内在水通道蛋白基因的克隆、表达和转基因研究[D];中国林业科学研究院;2012年
2 Shahjahan Shabbir Ahmed Rana;辣椒多聚半乳糖醛酸酶基因(CaPG)在茄科植物上的表达与功能分析[D];西北农林科技大学;2012年
3 周晓红;弓形虫MAG和tSAG1在转基因番茄中的表达研究[D];第一军医大学;2004年
4 唐前君;双生病毒外壳蛋白和传毒相关蛋白基因介导的病毒抗性研究[D];湖南农业大学;2010年
5 李丽娅;铁(Ⅲ)螯合物还原酶在植物铁代谢中的作用研究[D];哈尔滨师范大学;2011年
6 韩小娇;杨树木质部细胞程序化死亡的类Caspase、PtVPE与PtCDD作用研究[D];中国林业科学研究院;2011年
7 唐宏琨;激发子基因peaT1转化棉花和烟草体系的建立及功能分析[D];中国农业科学院;2010年
8 刘学奋;银杏黄酮相关基因的克隆及转化[D];复旦大学;2006年
9 范爱丽;大白菜细胞质雄性不育基因orf224和orf138表达载体构建及遗传转化[D];西北农林科技大学;2009年
10 杨应华;人源多肽抗生素LL-37/hCAP-18的初步研究[D];中国协和医科大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 马鑫;柚柠檬苦素葡萄糖基转移酶基因的克隆、表达及植物表达载体的构建[D];西南大学;2011年
2 郁萌萌;光叶楮再生体系的建立及农杆菌介导的AtNHX1基因转化光叶楮的初步研究[D];南京师范大学;2005年
3 蔺晓忠;密码子优化的O型口蹄疫病毒VPI基因转化饲草玉米的高效表达载体构建[D];甘肃农业大学;2007年
4 王心宇;番茄DR8基因启动子转化烟草及其定性研究[D];重庆大学;2009年
5 芮志佩;金属硫蛋白(MT)基因植物表达载体的构建及其在水生美人蕉中表达的初步研究[D];扬州大学;2009年
6 于丹丹;番茄转录因子SlMYB12介导的类黄酮合成过程中的功能研究以及水稻抗病相关基因OsDRxoc5的功能分析[D];山东农业大学;2011年
7 苏月焱;多基因植物表达载体的构建及转化分析[D];中国农业科学院;2013年
8 刘娜;无核荔枝中果胶乙酯酶基因转化番茄的研究[D];海南大学;2012年
9 王爱连;阔叶猕猴桃GalDH基因植物表达载体的构建及转化番茄的研究[D];西北农林科技大学;2011年
10 刘晓娜;植物凝集素基因植物表达载体的构建及遗传转化甘蔗[D];海南大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前4条
1 本报记者 薛冬  通讯员 潘楠;我国何以开展转基因抗虫棉研究[N];光明日报;2002年
2 王星海 本报记者 刘传书;从特区走出国门[N];科技日报;2003年
3 铁铮;基因技术消除杨树虫害[N];人民日报海外版;2003年
4 范天舒 郑爱中 关尔;“创世纪”:扬起转基因产业旗帜[N];大众科技报;2001年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978