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稻瘟菌插入突变体库的构建及产孢缺陷兼生长缓慢型突变体的分子遗传学研究

王刚  
【摘要】: 稻瘟菌为单倍体异宗配的合子囊菌,由其引起的稻瘟病是世界范围内危害水稻生产的一种重要病言。稻瘟病系统中,病菌与水稻间的互作符合基因对基因关系。稻瘟菌无毒基因和致病相关基因的克隆有助于解析稻瘟菌的致病专化性和致病机制。 本研究利用限制性内切酶介导的整合技术构建了迄今世界上最大的含有27063个转化体的稻瘟菌插入突变体库。所用的稻瘟菌Y34菌株经过对19个鉴别品种的致病性鉴定表明,该病菌含有13个无毒基因。构建含有编码潮霉素磷酸转移酶基因的双元载体pV2,该载体可以同时利用8种限制性内切酶进行转化。液体完全培养基摇培分生孢子40小时获得菌丝团,崩溃酶Drislease酶解3小时后获得最大量的原生质体,PTC滴加前后冰浴时间分别为20分钟和28分钟可以获得最佳转化效果。8种内切酶HindⅢ、SalⅠ、SacⅠ、SmaⅠ、EcoRV、ApaⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ的最佳转化浓度分别为30、20、20、20、20、20、30和20单位每皿。研究发现不同内切酶的转化效率不同,上述8种内切酶的最佳转化效率分别每皿48、48、35、17、14、39、30、27个转化体,平末端内切酶较粘性末端内切酶转化效率低。利用上述8种酶转化稻瘟菌获得的转化体数分别为3256、2956、2760、1443、2038、2996、2689、2827个。 为衡量插入突变体库的质量,从上述8种内切酶介导的转化体中分别随机抽取13个转化体,分别利用内切酶BglⅡ(质粒PV2上不含酶切位点)和相应的介导酶酶切进行Southern分析,结果表明,不同内切酶介导的转化体中质粒插入情况不同,质粒的插入共有多位点多拷贝、单位点多拷贝、单位点单拷贝以及质粒缺失插入四种类型,上述8种酶介导的转化体中,单位点插入的比例分别为 84o、83O、61o、92o、77O、77O、61o、92O,相应的单拷贝插入比例分别 为 69%、83%、54%、23%、15%、46%、46%、92%。不同酶介导的转化效率与 插入类型没有相关性。单位点插入比例与所用的内切酶切割方式无关,但是,粘 性末端内切酶介导的转化体中单拷贝插入和 REMI插入比例高于平术端内切酶 介导的比例。整个突变体库中,77%的单位点插入表明此突变体库有利于克隆相 ___I 关基因。1 此外,利用质粒 psacl 刁和 pCB 004,分别以 Sail 和 EcoAI 为介导酶转化稻 瘟菌 131菌株和 Y34菌株,分别获得 3995和 2012个转化体。 对稻瘟菌 131的一个 REMI突变体 H6进厅分子遗传学研究。鉴定其突变表 型,表明H6为产泡缺陷兼生长缓慢型突变体。Southern分析表明,此突变是由 转化质粒单拷贝插入的结果。将H6与相反交配型菌株1528有性杂交,分离出 ZI个子囊泡于,突变表型与野生表型比例为1:l,表明此突变表型山单基因控 制。潮霉素抗性与突变表型共分离表明外源质粒插入到基因的编码区。通过质粒 拯救获得插入位点侧翼基因组序列,部分测序和同源性比较显示其与其他己经报 道的基因没有同源性。暗示可能为一个新的基因,利用此序列筛选稻瘟菌基因组 文库,获得5个阳性克隆。此基因的克隆正在进行中。


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