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牛卵母细胞孤雌激活与体外受精

张琇  
【摘要】: 对牛卵母细胞孤雌激活与体外受精的研究,有助于揭示卵母细胞活化机制,为提高核移植效率和优化胚胎体外生产系统提供理论依据。本试验在牛卵母细胞体外成熟、体外受精、孤雌激活的基础上,重点研究胚胎培养,对比孤雌激活胚与体外受精胚的早期发育。研究结果如下: 1 在成熟培养液中添加10%或20%的bFF培养的卵母细胞孤雌激活后囊胚发育率(32.3%或30.9%)明显高于添加5%bFF或未添加bFF的对照组的囊胚发育率(21.8%或22.7%,P<0.05)。添加20%卵泡液的培养液对囊胚的孵化有抑制作用。 2 试验分别用三蒸水和Milli-Q超纯水配制的成熟液与胚胎培养液进行卵母细胞的体外成熟与胚胎培养。结果表明两种水质对卵母细胞成熟及胚胎早期发育卵裂阶段无显著影响(P>0.05)。但对胚胎后期发育有显著影响:在超纯水培养液中囊胚发育率为29.7%,显著高于在蒸馏水培养液中的囊胚发育率14.1%(P<0.05)。 3 卵母细胞成熟24h、26 h、28h、30h后除去外围卵丘细胞,在含有5μm ionomycin的培养液中激活5min,然后在含有2mM6-DMAP的培养液中孵育3h。结果表明:不同成熟时间对卵母细胞激活后的卵裂率无显著影响(P>0.05)。卵母细胞成熟28h或30h囊胚的发育率(30.5%或29.4%)明显高于成熟24h或26h的囊胚发育率(20.5%或22.1%,P<0.05)。 4 卵母细胞成熟28h后,在5μm ionomycin的培养液中激活5min,然后在含有2mM的6-DMAP的培养液孵育2h、4h、6h、8h。研究表明:成熟卵母细胞用6-DMAP激活2h的卵裂率(67.4%)明显低于激活4h、6h、8h的卵裂率(80.6%、84.1%、79.8%,P<0.05)。6-DMAP作用4h或6h的囊胚发育率(33.3%或30.4%)明显高于2h或8h的囊胚发育率(13.8%或20.5%,P<0.05)。表明6-DMAP作用时间以4h~6h为宜。 5 分别用单纯的BO与BO和M199成熟培养液的混合液(3:2,简称BM)作为受精液,观察受精液对牛卵母细胞体外受精及胚胎发育的影响。研究表明:两种受精用液对受精率无明显影响(P>0.05)。但在BM中的囊胚发育率(31.4%)明显高于在单纯BO液中的囊胚发育率(20.3%,P<0.05)。 6 在BO液中,精卵共育时间不同,对卵母细胞受精与胚胎发育的影响结果如 牛卵母细胞孤雌激活与体外受精 下:精卵共育 6 h受精率“9.5%)明显低于共育 9 h、12 h、24 h的受精率 (82.6%、83.1%、81.6%,P<o.05)。但精卵共育24 h后囊胚发育率门0.8%) 显著低于 6 h、9 h、12 h的囊胚发育率(22.3%、24.8%、23.9%,P<0.05)。 7 受精完毕,将假定受精卵分为三组分别移入:含有 0.6 m咖IBSA、0.3 mg/ml BSA+5%FBS、0.3 mg/thl BSA+5%OCS的三种 SOF培养液中培养。结果表 明:BSA单独或联合FBS、OCS使用对卵母细胞受精后的卵裂率无显著影响, 三种培养液均能支持胚胎发育到囊胚阶段。但受精卵在含血清qBS或OCS) 的培养基中囊胚发育率为20.4%或29.9%明显高于无血清培养基中的囊胚发 育率10.3%。尽管OCS与FBS对受精卵发育的促进作用无显著差异,但OCS 较FBS能更好支持早期胚胎发育。 8 使用M199、!nBECMaa、mSOFaa三种培养液培养体外受精卵,结果如下: M199、InBECMaa、mSOFaa均能支持体外受精卵发育到囊胚阶段。囊胚发 育率在ms**Maa(3o.7%)与m*OFaa(29.2%)之间无显著差异(P>o.05), 但二者明显高于M199门8%)(P<o.05)。 9 比较在相同条件下IVF卵(简称FE)与孤雌卵(简称PE)的发育率和发育 速度。结果表明:体外受精胚与孤雌激活胚的卵裂率抢2.5%,83.2%L囊 胚发育率(21.9%,2吕9%)、囊胚孵化率(53.3%,51.5%),差异不显著(P> 0刀5): 体外受精胚胎与孤雌胚胎发育速度基本相同。


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