绿脓杆菌外毒素A与人组蛋白H3嵌合蛋白基因克隆及表达的研究

【摘要】： 绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas Exotoxin A)为一条单链毒蛋白，通过对延伸因子EF-2的ADP-核糖基化作用而抑制真核细胞的蛋白合成。PEA具有三个功能区，分别为功能区Ⅰa、功能区Ⅰb，功能区Ⅱ和功能区Ⅲ。功能区Ⅰa负责识别和结合细胞，功能区Ⅱ负责跨膜移位，功能区Ⅲ具有ADP-核糖基化活性。人组蛋白H_3是碱性核蛋白，富含精氨酸。在生理条件下，H_3的精氨酸带正电荷，而DNA的磷酸基团带负电荷，所以组蛋白和DNA分子主要依靠静电引力相结合。本实验将PEA功能区Ⅰa、功能区Ⅱ基因片段和H_3基因片段连接，并构建原核表达载体，进一步获得嵌合蛋白，作为基因转染的广泛DNA载体蛋白旨在建立一种真核基因转染的新方法。从已构建的pCDPT_2质粒(含PEA全序列，由本室保存)中亚克隆获得PEA功能区Ⅰa及功能区Ⅱ基因片段(1100bp，含起始密码子)；提取人染色体DNA，以此为模板扩增获得了人组蛋白H_3基因片段(416bp)。将两基因片段分别克隆入pMD-18T载体中，提取克隆质粒；克隆质粒pMD-18T-PEA经Nco Ⅰ、Mlu Ⅰ双酶切，回收酶切产物；克隆质粒pMD-18T-H_3经Mu Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切，回收酶切产物。将PEA、H_3酶切产物连接，并以正确阅读框架插入经Nco Ⅰ、Xho Ⅰ酶切并回收的pET-28A原核表达载体中，经酶切分析及PCR检测，筛选到阳性克隆，其质粒测序结果表明成功地构建了毒性基因缺失的PEA与人组蛋白H3融合基因的原核表达载体。提取重组质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，对菌体总蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot分析，结果表明BL21(DE3)能有效表达目的蛋白，薄层蛋白扫描计算分析，显示表达蛋白带密度积分占总蛋白量的16.28％。大量诱导培养表达菌，制备包涵体，经侧带法纯化后加入弗氏佐剂制成免疫原，对獭兔进行3次(每次间隔14d)注射免疫，通过ELISA法测定，该重组蛋白能够诱导獭兔产生抗体，免疫后7～14d达到峰值，并初步制备了终点滴度为1：1600的兔抗PEA-H_3抗血清。从而为进一步的重组蛋白功能分析和基因转染实验奠定了基础。