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绿脓杆菌外毒素A与人组蛋白H3嵌合蛋白基因克隆及表达的研究

邓景致  
【摘要】: 绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas Exotoxin A)为一条单链毒蛋白,通过对延伸因子EF-2的ADP-核糖基化作用而抑制真核细胞的蛋白合成。PEA具有三个功能区,分别为功能区Ⅰa、功能区Ⅰb,功能区Ⅱ和功能区Ⅲ。功能区Ⅰa负责识别和结合细胞,功能区Ⅱ负责跨膜移位,功能区Ⅲ具有ADP-核糖基化活性。人组蛋白H_3是碱性核蛋白,富含精氨酸。在生理条件下,H_3的精氨酸带正电荷,而DNA的磷酸基团带负电荷,所以组蛋白和DNA分子主要依靠静电引力相结合。本实验将PEA功能区Ⅰa、功能区Ⅱ基因片段和H_3基因片段连接,并构建原核表达载体,进一步获得嵌合蛋白,作为基因转染的广泛DNA载体蛋白旨在建立一种真核基因转染的新方法。从已构建的pCDPT_2质粒(含PEA全序列,由本室保存)中亚克隆获得PEA功能区Ⅰa及功能区Ⅱ基因片段(1100bp,含起始密码子);提取人染色体DNA,以此为模板扩增获得了人组蛋白H_3基因片段(416bp)。将两基因片段分别克隆入pMD-18T载体中,提取克隆质粒;克隆质粒pMD-18T-PEA经Nco Ⅰ、Mlu Ⅰ双酶切,回收酶切产物;克隆质粒pMD-18T-H_3经Mu Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切,回收酶切产物。将PEA、H_3酶切产物连接,并以正确阅读框架插入经Nco Ⅰ、Xho Ⅰ酶切并回收的pET-28A原核表达载体中,经酶切分析及PCR检测,筛选到阳性克隆,其质粒测序结果表明成功地构建了毒性基因缺失的PEA与人组蛋白H3融合基因的原核表达载体。提取重组质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对菌体总蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot分析,结果表明BL21(DE3)能有效表达目的蛋白,薄层蛋白扫描计算分析,显示表达蛋白带密度积分占总蛋白量的16.28%。大量诱导培养表达菌,制备包涵体,经侧带法纯化后加入弗氏佐剂制成免疫原,对獭兔进行3次(每次间隔14d)注射免疫,通过ELISA法测定,该重组蛋白能够诱导獭兔产生抗体,免疫后7~14d达到峰值,并初步制备了终点滴度为1:1600的兔抗PEA-H_3抗血清。从而为进一步的重组蛋白功能分析和基因转染实验奠定了基础。


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