中国小麦条锈菌生理小种分子标记的研究

【摘要】： 小麦条锈病是我国小麦生产上的重要病害之一。合理使用抗病品种是防治小麦条锈病的经济有效措施。然而，品种抗锈性丧失是抗病品种应用中最突出的问题，研究表明条锈菌新小种的产生和发展是引致小麦抗病性丧失的主要原因。因而，监测小麦条锈菌生理小种的类型及小种组成的变化对于小麦条锈病的综合防治及抗病品种的选育具有重要的实际意义。小麦条锈菌属专性寄生菌，至今不能人工培养，常规的生理小种鉴定和毒性分析方法繁杂、费工费时，准确性易受到鉴定条件的影响；同时，由于鉴别寄主的数目相对有限，很难区分、鉴定出发生频率低的小种(致病类型)以及混杂在其它小种内的致病类型。这些都严重制约了条锈菌群体生物学的研究。 分子生物学的发展为研究病原菌自然群体的遗传结构和流行区系间的关系、监测各地生理小种的组成及变异动态提供了新的方法。鉴于小麦条锈菌是专性寄生菌，无有性阶段，目前其遗传背景仍不清楚，本文拟采用RAPD技术，通过揭示小麦条锈菌生理小种间及生理小种内的遗传多样性，寻找主要流行小种的特异性分子标记，从而为建立具有实用价值的中国小麦条锈菌生理小种的快速分子检测体系奠定基础。本文取得了以下主要结果： 1．改进并比较分析了适用于小麦条锈菌基因组DNA提取的氯化苄法和CTAB／SDS法，使小麦条锈菌基因组DNA的得率提高到300～700μg／g夏孢子，研究表明CTAB／SDS法提取的条锈菌基因组DNA无降解，质量高，更适合于小麦条锈菌的分子生物学研究。 2．对小麦条锈菌的RAPD反应条件进行了优化，建立了适用于小麦条锈菌的标准化RAPD反应体系：10×Reaction Buffer 2.5μl，MgCl2 2mmol／L，dNTPs 0.15mmol／L，模板DNA 40ng，引物10ng，Taq1.5U，ddH2O 15.5μl。扩增条件：94℃，5rain，一个循环；94℃，30s，36℃，40s，72℃，90s，45个循环；最后72℃延伸7min。多批次的扩增实验证明该反应体系的稳定性好，重复性强。 3．本研究共选用了210条10碱基随机引物，发现其中134条引物可以得到稳定清晰的扩增图谱。对中国小麦条锈菌5个主要生理小种26个单孢菌系进行的RAPD分析表明：中国小麦条锈菌各生理小种间的遗传变异丰富，但一些基因组区段仍具有一定的保守性。而生理小种内不同单孢分离系间没有RAPD谱型的差异，生理小种内 的遗传基础相对一致。 4.本研究寻找到了条中31号、条中29号、条中23号、水源类型的特异性RAPD 标记，并进行了单抱菌系的验证。通过对条中31号、条中29号特异RAPD片段的 回收、克隆和测序，设计了两对特异PCR引物，成功获得条中31号、条中29号小 种专化的SCAR标记。 上述结果表明通过大规模寻找小麦条锈菌生理小种的特异性RAPD片段，可以 建立起中国小麦条锈菌流行生理小种的分子鉴定、检测体系，简化常规鉴定的繁琐程 序，缩短鉴定周期，这对及时准确了解条锈菌群体的组成与时空变化，客观认识小麦 条锈菌的群体生物学特性，控制锈病流行以及抗病品种的选育、布局具有重要意义。