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枯草杆菌生物素操纵子基因的克隆、序列改造及功能表达研究

林峰  
【摘要】: 利用基因工程技术生产生物素是国际上高技术竞争的又一热点。由于生物素能够提高家畜胴体质量和改善肉质,提高家畜繁殖力,是家畜品种性能正常发挥所必需的物质。目前,生物素只能通过化学合成方法获得,且均从国外进口,价格昂贵,制约了我国畜牧科技和产业的发展。随着基因工程技术的兴起,人们开始转向生物素生物合成的研究。生物合成方法可以进行生物素的专一性合成,克服了化学合成法收率低,不能专一性合成,需经高成本化学拆分过程才能获得d-生物素的弊端,可使生物素的生产成本降低,从而提高畜牧业的经济效益。我国尚无这方面的研究,因此,开展本研究具有重要的理论意义和经济价值。 本研究以枯草杆菌ASl.1094菌株为研究材料,克隆了生物素操纵子基因,并对基因序列进行改造。而后对改造后的生物素操纵子基因进行了功能表达检测及bioW与bioB基因的诱导表达。旨在探索如何提高生物素操纵子基因的表达效率,为该操纵子基因的高效表达提供可行的研究路线和理论依据。并构建了可商业化操作的研究素材,为以后的研究提供探索性经验。本论文主要作了以下几方面的研究: 1.大片段基因组DNA的提取 为了获得用于PCR扩增(长距离PCR扩增和分段PCR扩增)的高纯度、大片段(至少为PCR产物长度的4倍)的DNA模板,应用三种方法:低熔点琼脂糖包埋法,SDS-蛋白酶K-酚氯仿抽提法和细菌基因组DNA提取试剂盒法,分别提取获得了枯草杆菌基因组DNA,并对3种方法的操作程序进行了不同程度的改进,结果表明:低熔点琼脂糖包埋法提取的基因组DNA片段明显大于后两种方法,采用0.5%琼脂糖凝胶电泳3h,仍然跑不出加样孔。将该方法提取的基因组DNA稀释100倍作为模板,采用长距离PCR方法,获得了枯草杆菌生物素操纵子基因全长。说明以低熔点琼脂糖包埋法提取枯草杆菌基因组DNA,并获得较大的DNA片段,是完全可行的。 2.枯草杆菌生物素操纵子基因的克隆 将枯草杆菌基因组DNA稀释后,通过PCR反应条件的优化,分别扩增得到了生物素操纵子基因的长距离PCR产物(10.3kb)和3个分段PCR产物。而后采用TA克隆方法,经PCR产物的纯化、两端加A、pGEM-T载体连接、转化大肠杆菌、阳性克隆的酶切鉴定及重组质粒测序,分别获得了生物素操纵子基因3个片段(bio-1、bio-2、bio-3)的克隆质粒。应用分子生物学软件对测序结果进行了分析,并与Genebank中枯草杆菌168菌株的生物素操纵子基因序列进行了对比分析:共有12个碱基差异,且7个碱基导致了氨基酸变异,但未出现移码突变现象。 利用长距离PCR扩增引物为测序引物,利用PCR产物直接测序法,在长距离PCR产物两侧各测了1个反应,并与Genebank中168菌株序列进行了对比分析:两个菌株的序列基本吻合,只有1个碱基的差异。 通过2种方法对3个基因片段的转化效率比较和质粒浓度的测定(重复多次), 结果表明:biow基因作为大肠杆菌的外源基因,插入高拷贝的pGEM一T载体中,重 组后的质粒具有不稳定性。 3.枯草杆菌部分基因组文库的构建及筛选 首先,通过对枯草杆菌生物素操纵子基因序列和基因组序列的分析,选择刀。脚Hl 和KPnl位点。用这2个内切酶分别将基因组DNA和BluescriPt SKM13载体完全酶 切消化,分别纯化回收(酶切的基因组DNA回收4.3一7kb间的片段),并用几DNA Ligase连接,转化大肠杆菌DHS。。 应用PCR快检法对构建的枯草杆菌部分基因组文库进行了筛选,共检测了250 个菌落,得到了3个阳性克隆子,经酶切鉴定和测序,获得了生物素操纵子5.Ikb的 BamHI一KPnl亚克隆片段。测序结果表明:ASI .1 094菌株与168菌株bioAFDB基因 序列完全一致,9个差异碱基是由于PCR扩增导致的。 枯草杆菌生物素操纵子基因4个亚克隆序列的测序结果证实,ASI .1 094菌株和 168菌株生物素操纵子基因序列是完全一致的(见附件1)。 4.枯草杆菌生物素操纵子基因序列的改造 基因序列改造的关键是删除bioB与biof基因间的终止子,在Bowe:等(1 996) [’97]序列研究分析的基础上,设计一对PcR引物,以bi。一2片段克隆质粒为模板,采 用Skip PCR方法,得到了约4.3kb产物,以TA克隆方式,插入pGEM一T载体中。将 经鉴定的阳性克隆质粒进行测序,结果表明:bioB与biol基因间的5 lbp的终止子序 列已被删除。在基因序列分析的基础上,采用特征酶酶切的方式,还删除了生物素操 纵子基因上、下游与生物合成无关的序列。并将改造后的枯草杆菌生物素操纵子基因 的3个片段依次插入pGEM一T载体中。并经binw、bioB及biol基因3’端的引物进 行PCR扩增和重组质粒酶切鉴定而得到证实。 5.改造后的生物素操纵子基因的功能表达检测及biow和 bioB基因的诱导表达 为了检测改造后的生物素操纵子基因是否能够正常表达,我们利用生物素是细菌 生长的必需物质这一特点,用4种大肠杆菌生物素缺陷株(R874、R875、R877、R879) 经遗传互补分析表明:改造后的生物素操纵子中的bioA、binF、bioD、bioB4个基因 均能够表达。因此,bioB与biof基因间终止子序列的删除,不影响基因的表达。 同时也证实,虽然所克隆的枯草


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