H5亚型禽流感病毒HA DNA疫苗的研究

【摘要】： 禽流感是由A型流感病毒引起的禽类烈性传染病，严重威胁世界各地的养禽业，常常造成巨大的经济损失，尤其是H5、H7亚型引起的高致病力禽流感是养禽业的一种毁灭性疾病。血凝素(Hemagglutinin，HA)是禽流感病毒的重要的保护性抗原，是构建DNA疫苗的首选基因。本实验对禽流感HA DNA疫苗做了研究，主要包括HA基因真核表达质粒的构建表达、HA DNA疫苗的BALB/C小鼠免疫和攻毒保护实验、HA DNA疫苗的SPF鸡免疫和攻毒保护实验等三方面的内容。 1．禽流感病毒HA基因真核表达质粒的构建与表达。HA基因是禽流感病毒重要的保护性抗原基因。为了研究HA基因疫苗，用PCR扩增H5亚型禽流感病毒HA基因，将其克隆到质粒pcDNA4/HisMax和pRc/CMV上得到真核表达质粒pC4H5和pCMVH5。采用Tfx~(TM)-20、Superfect转染试剂和电转染法转染Hela细胞，转染后的Hela细胞经Western Blotting和血凝试验检测HA蛋白及其活性。结果表明，Superfect转染和电转染均能正确表达HA蛋白并具有生物学活性，Western Blotting检测到HA和HA裂解的HA1和HA2，与禽流感病毒的HA、HA1、HA2蛋白的分子量一致。从血凝试验结果看，Superfect和电转染表达的HA均具有血凝活性，而经Superfect转染的pC4H5的表达量是pCMVH5的8倍，表明pC4H5是一高效的真核表达质粒。 2．HADNA疫苗的小鼠免疫和攻毒保护实验。将构建好的真核表达质粒pC4H5和pCMVH5采用电击和肌肉注射免疫小鼠，电击条件为电压200V/cm，脉冲数8个(+4，-4)，脉冲时间40ms,质粒用量为30μg/只。第3周以相同的条件加强免疫一次，第5周用戊巴比妥(50mg/kg)麻醉小鼠，以10~(5.8)ELD_(50)的H5亚型的禽流感病毒经滴鼻进行攻毒。在实验期间进行了小鼠抗HA的IgG抗体、淋巴增值实验。CTL实验、CD4~+和CD8~+分型、IFN-γ及IL-4细胞因子等免疫指标的检测。结果为，电击组小鼠在第2周产生抗体，肌肉注射组在第4、5周产生抗体，电击组优于肌肉注射组，淋巴增值实验和CTL实验表明，第4周机体的细胞免疫被激活，攻毒后细胞免疫进一步活化。CD_4~+/CD_8~+比率及血清中细胞因子IFN-γ、IL-2随着免疫次数的增加，呈现逐步升高趋势，2种质粒免疫鼠之间差异不显著(p＞0.05)，但实验组与对照组相比差异显著(p＜0.05)，说明构建的DNA疫苗能激活机体的免疫系统。 攻毒后，对照组小鼠在攻毒后第9、10d死亡，并且自始至终均能分离到病毒。而电击组和肌肉注射组小鼠均能获得保护，但电击组在攻毒后第5、7、16d肺脏中均分离不到病毒。肌肉注射组在第5d均能分离到病毒，第7d部分小鼠能分离到病毒，第16d分离不到病毒。结果表明，电击免疫明显优于肌肉注射，说明电击免疫是一种比较理想的免疫方法。 H5亚型禽流感病毒HA DNA疫苗的研究 3.HA DNA疫苗的sPF鸡免疫和攻毒保护实验。我们采用30林岁只和50林留只两个 剂量，经肌肉注射和电击法免疫SPF鸡，每周检测SPF鸡的HA抗体，二免后第二周用 1价ZELDS。的HS亚型禽流感病毒攻毒。结果为，电击法免疫sPF鸡在第2周产生抗体， 再次免疫后抗体水平明显升高，50卜留只的肌肉注射组在第4周产生微量抗体。 攻毒保护结果为，30林岁只和50“g/只两个剂量的电击免疫组对鸡的保护率分别为 83.3%和100%，而肌肉注射组不能保护攻毒剂量的HS亚型禽流感病毒的攻击。说明电 击免疫是一种比较理想的免疫方法。