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小茎尖培养结合热处理脱除樱桃ACLSV和PNRSV的研究

彭向永  
【摘要】: 本研究以甜樱桃(Prunus.avium L.)品系6-7、6-3和三倍体杂种樱桃Gisela5(P.cerasus×P.canescens)为试材,首先通过对影响樱桃小茎尖培养的若干因素的研究,建立了樱桃茎尖培养的快繁体系。初代培养取休眠芽和生长的茎尖,流水冲洗1~2h,经70%的乙醇表面消毒15~30S和0.1%的升汞消毒5~10min后,无菌水冲洗5次,在超净工作台上取0.5~1.0mm的小茎尖接种于WPM基本培养基并附加BA0.5mg/1、IBA0.2mg/1和GA_30.2mg/1,6-7、6-3和Gisela5的成活率分别为100%、91.6%和100%。继代培养采用MS和F_(14)培养基交替使用并附加BA1.0mg/1、IBA0.2mg/1,同时研究了蔗糖浓度、培养基,pH值对增殖的影响。试验结果表明,外植体在附加蔗糖2~3%,pH值为5.2~6.0的培养基上均能较好的生长,基本无玻璃化、茎尖枯顶和坏死现象。以F_(14)生根培养基为基本培养基,采用L_9(3~4)正交试验设计,系统地研究了影响樱桃生根和移栽的因素。结果表明,培养基附加IBA0.7mg/1和NAA1.0mg/1,18d后平均生根率达70%以上,根粗壮、二次根发达,炼苗后栽入蛭石中成活率达90%以上。 在建立樱桃小茎尖培养体系的基础上,进行了热处理结合小茎尖培养脱除ACLSV和PNRSV的研究。将试材在38℃下处理3周,取0.5~1.0mm的小茎尖培养,充分扩繁后,病毒检测结果为:热处理试管苗结合小茎尖培养(处理1),三个品种均接种小茎尖50个,6-7、6-3和Gisela5分别成活16、24和30个,无ACLSV茎尖分别为4、7和3个,脱毒率分别为25.0%、29.2%和10.0%;无PNRSV茎尖分别为7、11和9个,脱毒率分别为43.8%、45.9%和30.0%。热处理盆栽苗结合小茎尖培养(处理2),6-7和6-3两个品种分别接种小茎尖25和20个,分别成活24和16个,无ACLSV茎尖分别为9和5个,脱毒率分别为37.5%和31.3%;无PNRSV茎尖分别为14和10个,脱毒率分别为58.3%和62.5%。单独取小茎尖0.5~1.0mm(处理3)得到的茎尖培养物经检测极少脱除病毒。综合来说,方法2的脱毒率显著高于方法1,方法1又优于方法3,这说明单独使用小茎尖培养很难脱除核果类果树ACLSV和PNRSV病毒,而热处理与小茎尖结合则可以较好地解决这个问题。 对组织总RNA的提取方法进行了改进,使提取时间缩短至3h以内,这种方法更适合于樱桃幼嫩叶片和试管苗RNA的提取,操作简单,提取的RNA完整性好,含量和纯度达到了RT-PCR检测病毒的要求,每个样品可节约1元。以含有病毒的材料为对照,按照病毒外壳蛋白基因的一段保守序列设计引物,经RT-PCR反应后,电泳可观察到带有ACLSV和PNRSV的株系分别含有358bp和449bp的特异片段,而无病毒株系则没有特异带产生。


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