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柿果实扩张蛋白cDNA克隆及其生物活性研究

童斌  
【摘要】:本文以中国柿(Diospyros Kaki L. cv Fuping jianshi)为试材,在果实不同发育时期分别提取总RNA,根据其他已知序列设计简并引物,进行RT-PCR,获得了柿果实扩张蛋白expansin cDNA片断2个,对其序列进行了同源性比较分析;同时研究了柿果实采后呼吸、硬度,expansin活性的变化及其对组培苗生长的影响。 1.建立了适合柿果实总RNA提取的改进热硼法 改进的热硼法中,将DTT和SDS的浓度提高了5%,proteinase K加入量提高到150μl,并对首次离心延长时间10分钟,保证了总RNA的提取质量。 2.建立了柿果实expansin RT-PCR体系 优化后100μl体系中各组分浓度为:1.5mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、25μmol/L简并引物、0.5ng cDNA、1.5U Tag酶。该体系反应产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳,可获得带型清晰,重复性好的cDNA片段。 3.获得了柿果实expansin cDNA片段 以果实三个发育时期的RNA为模版,根据expansin保守区域序列设计简并引物,通过RT-PCR,获得了2个柿果实expansin cDNA片段:Cdk-exp1和Cdk-exp2。对两个片段核苷酸和氨基酸序列进行了同源性分析。 4.研究了柿果实不同发育时期expansin的生物活性及其与果实软化的关系 实验结果表明,柿果实不同发育时期都具有一定的expansin活性。在果实膨大期和软化加速之前,expansin活性维持较高水平。expansin与果实软化关系密切。 5.柿果实expansin蛋白对百合组培苗的生长具有明显促进作用 用不同时期,不同浓度柿果实expansin提取液处理百合组培苗,一定程度地促进了幼苗的生长,其中以果实膨大期3.0g/L expansin粗提液的处理效果最为突出。


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