收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

基因芯片检测新城疫病毒和PCR结合内切酶分析鉴别新城疫强弱毒株的研究

耿捷  
【摘要】:新城疫(New Castle Disease,ND)是新城疫病毒引起的一种急性、高度接触性禽类传染病,被世界动物卫生组织(OIE)定为A类传染病。新城疫病毒(NDV)是副黏病毒科、副黏病毒亚科、腮腺炎病毒属的成员,为有囊膜的负链RNA病毒,可存在于病禽的所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中。目前国内对于新城疫的诊断,主要是采用传统的病原分离鉴定及血凝抑制试验(HI)等血清学试验,与西欧、美国和日本等一些国家所采用的分子生物学诊断方法相比,技术上有较大的差距。我国加入WTO后,禽类产品国际贸易进一步增加,但传染病病原检测技术上的差距在禽类产品检验检疫中表现得更为突出,使我国禽类产品贸易在国际竞争中处于劣势。为改变这一不利局面,研究先进的传染病病原检测方法已成为当务之急。 OIE推荐的诊断新城疫的方法有病毒分离鉴定,HI,鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)、6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)等致病指数试验,这些试验不但需要较长的时间,而且有散毒的隐患。目前我国出入境检疫中对新城疫病毒的检测方法主要有泻殖腔棉拭子样品病毒分离鉴定、HI和ELISA,RT-PCR检测技术正在试用之中。国外一些学者利用RT-PCR和nested-PCR结合序列分析等分子生物学技术对NDV进行了检测研究,这些技术具有快速、准确、无散毒性等特点,已被OIE推荐为评估NDV毒力的试验方法,西欧少数国家和日本在禽类产品国际贸易中已经开始采用这些方法进行NDV检疫,这些都为NDV检测技术的发展奠定了基础。 基因芯片技术近年来在分子生物学研究和疫病检测方面发挥着越来越大的作用。利用基因芯片可加速对病毒基因组的功能分析;可建立遗传病的突变检测技术,并成为对多种遗传病的常规诊断技术;可用来监测宿主细胞基因表达的改变,研究病毒的致病机理;基因芯片还可用来对细菌基因的分型和菌种鉴定,为筛选和监测细菌的抗药性基因提供基础数据。目前我国在出入境检验检疫中,已开始在基因芯片技术检测传染病病原方面开展了研究工作,国家质检总局动植物检疫所研制出了检测SARS病毒的全基因芯片,极大的促进了出入境检验检疫检测技术的发展,但目前国内外尚未见到有关新城疫病毒基因芯片的报道。 本文开展了基因芯片技术检测新城疫病毒和RT-PCR结合内切酶技术鉴别新城疫强弱毒株的研究,为我国对新城疫的快速准确诊断奠定了技术基础。 1.应用基因芯片技术检测新城疫病毒 在本试验中,我们依照寡核苷酸探针设计原则,设计出了30条20 mer寡核苷酸阵列,以期能平行、特异的检测NDV。通过对6株病毒的检测结果显示,在探针位点上, WP=6 6个样品均检测到了阳性的荧光信号,而阴性及空白对照没有检测到信号,说明本芯片具有较好的稳定性和灵敏性。通过特异性试验检测禽流感病毒(AIV)H5、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的结果也表明,芯片杂交信号正确,具有良好的特异性。由于该芯片敏感性强、准确性高、特异性强、重现性好,且操作简单,成本较低,为新城疫病原的检测提供了一种新的有效手段,完全适用于新城疫病原的大规模筛检和快速检测,对出入境动物检验检疫具有重大意义。 2.应用RT-PCR结合内切酶技术鉴别新城疫强弱毒株 本试验扩增的序列为新城疫病毒F-糖蛋白基因的4893~5031序列,在其弱毒株序列中有BglⅠ内切酶的酶切位点,而此位点是强毒株序列所没有的。根据这一特性,用RT-PCR方法结合内切酶分析来鉴别45株NDV分离株的毒力,此结果与OIE标准中MDT毒力测定结果基本一致。在45株NDV分离株中,41株酶切结果只有202bp片段,为强毒株,与MDT结果相同。其余有4株(序号为8,9,10,44)的MDT在60h以上,其酶切结果表明2株(10,44)只有135bp和67bp,为弱毒株,2株(序号为8,9)除135bp和67bp,还有202bp片段,表明这2个毒株含有强弱毒双重序列,怀疑可能是受到强毒污染所致;弱毒株对照LaSota株的酶切结果清楚显示只有弱毒株序列。国内2株疫苗株的分析结果为弱毒序列。说明此方法可区分强毒株、弱毒株及疫苗株。 应用RT-PCR对国内的45株分离株进行PCR扩增,其结果进一步证实了分离NDV的其他血清学结果(HA,HI等)。结合内切酶分析,能更进一步确定分离株毒力的强弱。传统的MDT,ICPI和IVPI等强弱毒鉴定方法过程繁琐,操作费时、费力,从接种到结果判定需7~10d的时间,并且在操作过程中有引起交叉污染和散毒的可能性。本试验采用RT-PCR结合内切酶分析,有效的避免了这些方法的不足,并且操作简便、快速,可在24~36h内确定分离株的毒力,也减少了散毒和分离样品在处理过程发生交叉污染的可能性。该方法不仅能鉴别样品中新城疫病毒的强弱,还可诊断APMV-1引起的其他禽类的感染,如本研究中诊断企鹅,鸽子和鸵鸟的感染等,因此,对促进出入境动物检验检疫技术的发展,打破发达国家的技术壁垒具有重大意义。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王忠田,王泽霖,陈溥言,杨汉春;新城疫病毒分子生物学最新研究进展[J];动物医学进展;2002年02期
2 吴艳涛,倪雪霞,万洪全,刘文博,刘秀梵;我国部分地区不同动物来源新城疫病毒的分子流行病学研究[J];病毒学报;2002年03期
3 熊永忠,王秀荣,曹殿军,刘培欣,张勇;鸽源新城疫病毒的分离与鉴定[J];黑龙江畜牧兽医;2002年05期
4 钱晨,钱忠明,印继华;鸭源新城疫病毒的分离鉴定及生物学特性[J];扬州大学学报;2005年03期
5 周伦江;庄向生;陈少莺;;新城疫病毒的分子生物学及应用研究进展[J];中国家禽;2006年20期
6 曾显成;;鹌鹑新城疫病毒的分离与鉴定[J];江西畜牧兽医杂志;2007年05期
7 宋宗好;花召栋;提金风;姚火春;;鹅源新城疫病毒的分离及生物学特性研究[J];畜牧与兽医;2007年06期
8 王振辉;武桂梅;张桂荣;刘军;郑长宏;吕礼良;;喜鹊新城疫病毒的分离、鉴定与生物学特性研究[J];黑龙江畜牧兽医;2009年05期
9 宋庆华;贾松涛;刘炜;刘星;房大学;王辉;;郑州地区新城疫病毒的分离与鉴定[J];上海畜牧兽医通讯;2010年06期
10 邹海涛;兰邹然;姜平;;新城疫病毒结构蛋白功能及检测技术研究进展[J];动物医学进展;2012年04期
11 黎先伟;;新城疫病毒在全球的变异研究[J];兽医导刊;2012年05期
12 陈安莉;谢芝勋;刘加波;庞耀珊;邓显文;谢志勤;谢丽基;范晴;;白鹭源新城疫病毒的分离与鉴定[J];动物医学进展;2012年07期
13 吴双;刘秀梵;王晓泉;朱善元;王安平;王永娟;洪伟鸣;左伟勇;;基于比较蛋白质组学研究新城疫病毒的入胞机制[J];中国家禽;2012年21期
14 梅建国;庄金秋;姚春阳;沈旭;沈志强;;新城疫病毒培养技术研究进展[J];畜牧与兽医;2013年10期
15 刘红,秦卓明,孙树清,金维江;嗜神经型新城疫病毒的分离与鉴定[J];山东家禽;1997年06期
16 李凌程;;一株新城疫病毒的分离和鉴定[J];中国畜禽种业;2014年06期
17 王志亮,杜文金,孙振涛,单良刚,郑东霞,张子春,宋翠平,孙融冰,况慧星;新城疫病毒的分离与分子生物学分析[J];中国预防兽医学报;2000年S1期
18 王兴龙;新城疫病毒分子生物学(待续)[J];动物科学与动物医学;2001年03期
19 王兴龙;新城疫病毒分子生物学(续完)[J];动物科学与动物医学;2001年04期
20 刘华雷,王永坤,朱国强,严维巍,田慧芳,周继宏;一株基因Ⅶ型新城疫病毒的分离及分子鉴定[J];中国兽医学报;2002年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘家国;徐玉凤;赵彪;王德云;范云鹏;胡元亮;;板蓝根生物碱酸性部位对新城疫病毒吸附、释放的影响[A];中国畜牧兽医学会2010年学术年会——第二届中国兽医临床大会论文集(下册)[C];2010年
2 瞿国润;吴艳涛;张如宽;刘秀梵;;我国部分地区新城疫病毒分子流行病学及其生物学特性的研究[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年
3 胡北侠;吴艳涛;刘秀梵;张如宽;;新城疫病毒融合蛋白单克隆抗体的研制[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年
4 宋翠萍;陈晓兰;丁铲;;新城疫病毒致病力演变研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会成立大会暨第一次学术研讨会论文集[C];2008年
5 徐明;毕玉海;李志杰;李茂;丁壮;;新城疫病毒种间传播的分子基础[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集[C];2005年
6 孙健;单虎;宫文妮;;山东省新城疫病毒资源库的评价[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
7 刘秀梵;胡顺林;;我国新城疫病毒的分子流行病学及新疫苗研制[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2010年
8 常维山;;利用序列分析资料鉴别新城疫病毒强弱毒株的方法与应用[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年
9 张鹤晓;赖平安;刘环;刘继红;郭晋优;谷强;张利峰;汪琳;段生涛;张向东;孙颖杰;朱文斯;杨伟;黄茜华;赖少梅;李宁;;荧光RT-PCR检测活禽和禽产品中新城疫病毒中强毒株的研究[A];中国畜牧兽医学会2003年学术年会论文集[C];2003年
10 闫丽辉;曹殿军;;新城疫病毒分子生物学概述[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(下)[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李晓霞;新城疫病毒气溶胶发生与传染机制及其在生产鸡舍环境中的监测[D];山东农业大学;2009年
2 程相朝;新城疫病毒地方株分子流行病学调查及其疫病控制[D];南京农业大学;2003年
3 胡海霞;表达C亚型禽偏肺病毒糖蛋白和融合蛋白的重组新城疫病毒二价苗的构建及免疫效力评价[D];吉林大学;2011年
4 詹媛;新城疫病毒通过激活真核翻译起始因子4F促进病毒增殖[D];中国农业科学院;2014年
5 闻晓波;新城疫病毒样颗粒的构建及其出芽机制的研究[D];中国农业科学院;2006年
6 孙英杰;细胞自噬在新城疫病毒感染过程中的作用[D];中国农业科学院;2013年
7 刘佳旭;应用反向遗传操作系统研究鹅源新城疫病毒NP基因5'非编码区六个核苷酸对病毒毒力的影响[D];吉林大学;2015年
8 蔡丽娅;临床新城疫病毒分离鉴定及F蛋白单克隆抗体的研制与应用[D];扬州大学;2009年
9 耿捷;基因芯片检测新城疫病毒和PCR结合内切酶分析鉴别新城疫强弱毒株的研究[D];西北农林科技大学;2004年
10 徐怀英;新城疫病毒山东流行株分子演化及抗原性变异分析[D];中国农业大学;2014年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 田明尧;多亚型流感和新城疫病毒诊断基因芯片的初步研究[D];吉林大学;2008年
2 陈娟娟;胶体金免疫层析试纸条检测新城疫病毒方法的建立及初步应用[D];扬州大学;2009年
3 刘春国;新城疫病毒样颗粒的研究[D];中国农业科学院;2004年
4 吴扬;一株新城疫病毒分离株生物学特性的初步研究[D];扬州大学;2006年
5 马馨;山西省鸡源新城疫病毒基因特性分析[D];山西农业大学;2013年
6 梅双双;新城疫病毒野毒株的分离鉴定及其融合蛋白部分序列同源性分析[D];河北农业大学;2002年
7 弋英;荧光RT-PCR检测新城疫病毒及其毒力鉴别[D];南京农业大学;2004年
8 崔平福;新城疫病毒融合蛋白高效表达及其特异性单克隆抗体的研制和初步应用[D];扬州大学;2007年
9 石跃;新城疫病毒对鸭致病性研究[D];中国农业科学院;2011年
10 姚春峰;我国部分地区新城疫病毒的部分生物学特性鉴定及分子流行病学研究[D];扬州大学;2007年
中国重要报纸全文数据库 前5条
1 哈冰;揭开新城疫病毒奥秘的曹殿军[N];农民日报;2001年
2 秦卫红;种鹅感染新城疫病毒的诊断[N];中国畜牧兽医报;2013年
3 宁启文;我国研制成功H5亚型禽流感重组新城疫病毒活载体双价疫苗[N];农民日报;2005年
4 刘万珍;哪些畜禽不能混养[N];农民日报;2013年
5 ;夏季怎样提高养鸡效益[N];中国畜牧兽医报;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978