牛生长发育性状候选基因的分子标记研究

【摘要】：本研究以鲁西牛、南阳牛、中国西门塔尔牛为试验动物，利用 PCR-SSCP 和 PCR-RFLP 技术研究了三个牛品种 GH、GHR、IGF-I、IGF-IBP3 四个候选基因上的 遗传变异，以肉牛线性体型评分方法和体尺性状作为衡量牛生长发育的指标，运用最 小二乘拟合线性模型，对所发现的多态位点与牛生长发育性状的关系进行了分析，探 讨了 GH、GHR、IGF-I、IGF-IBP3 基因作为影响牛生长发育候选基因的可能性，所 获得结果如下： 1. GH 基因第 3 内含子、第 4 内含子、第 5 外显子、3’ 端、5’端位点多态 以及与 牛生长发育性状的关系 （1）GH 基因第 3 内含子的 PCR-SSCP 多态性检测结果表明：该多态位点由一对等 位基因 A、B 控制，1547bp 处碱基 C→T 的替换造成该多态位点。等位基因 A（B） 在鲁西牛、南阳牛、中国西门塔尔牛群体中的基因频率分别为：0.0957(0.9043)、 0.2619(0.7381)、0.3477(0.6523)，等位基因 B 为三个群体中的优势等位基因。 （2）GH 基因第 4 内含子的 PCR-SSCP 分析结果表明：此位点存在品种间差异；在 西门塔尔牛群体中，该多态位点的产生是由于 1978bp 处发生碱基 T→C 的替换；而 在鲁西牛、南阳牛品种中，该位点在 1947bp 处发生碱基 T→G 的突变。 （3）GH 基因第 5 外显子的 PCR-SSCP 分析结果显示：该多态位点的产生是由 2141bp 处碱基 C→G 的突变引起的，使得亮氨酸变成缬氨酸，造成氨基酸发生变化。等位基 因 A（B）在鲁西牛、南阳牛、中国西门塔尔牛群体中的基因频率分别为： 0.2234(0.7764)、0.2262(0.7738)、0.4882(0.5118)。在此位点鲁西牛、南阳牛处于 Hardy-weinberg平衡，而中国西门塔尔牛处于非平衡状态。 （4）GH 基因 3’端的 PCR-RFLP 结果表明：由于 2639bp 处碱基 GCC→GGC 的突变 造成 HaeⅢ酶增加一个酶切位点，该多态基因座位表现 3 种基因型 AA、AB、BB 基 因型，其中 AB 基因型由大小分别为 256bp、206bp、199bp、50bp 的四个片段组成。 在此位点中国西门塔尔牛等位基因 A 占优势，而鲁西牛、南阳牛等位基因 B 占优势。 WP=13 ii 牛生长发育性状候选基因的分子标记研究 （5）GH 基因 5’端 PCR-SSCP 结果分析表明，该多态位点的产生是由 303bp 处碱基 C→T 的突变造成。等位基因 A（B）在鲁西牛、南阳牛、中国西门塔尔牛群体中的 基因频率分别为：0.4222(0.5778)、0.4268(0.5732)、0.3140(0.6860)，等位基因 B 为优 势等位基因。 （6）利用最小二乘拟合线性模型对 GH 基因上 5 个多态位点不同基因型与生产性状 指标进行显著性检验，结果表明：GH 基因第 5 外显子（GH-P3）、3’端（GH-P4）位 点上 AB 基因型的体重、体高、体斜长、胸围和肉用指数显著高于 AA、BB 基因型 （P0.05）；BB 基因型的个体体重、体高、体斜长、胸围和 BPI 略高于 AA 基因型， 但差异不显著（P0.05）。因此，等位基因 B 可初步确定为影响牛体重、体高、体斜 长、胸围和 BPI 的优势基因。在肉牛改良中，可通过选择含有 GH-P3、GH-P4 位点 的 B 等位基因的个体，以便提高牛生长发育性状的选择效果。 2. 牛 GHR 基因的第 8外显子、第 9外显子、5’ 端、第 3外显子均未发现 PCR-SSCP 和 PCR-RFLP 多态。 3. 牛 IGF-I 基因第 2外显子、5’端、第 5外显子、第 5内含子座位多态以及与牛生 长发育性状的关系分析 （1）首次在牛 IGF-I 基因第 2 外显子上发现 PCR-SSCP 多态，多态位点有一对等位 基因 A、B，该多态位点的产生是由于 3620bp 处碱基 A→G 的突变；3628bp 处碱基 C→T 的突变以及 3842bp 处碱基 A→G 的突变造成的；在鲁西牛、南阳牛、西门塔尔 牛群体中等位基因 A（B）的基因频率分别为 0.1489(0.8511)、0.0476(0.9524)、 0.0000(1.0000)，等位基 B 为优势等位基因，该座位处于 Hardy-weinberg平衡。 （2）牛IGF-I 基因的5’ 端、第5 外显子、第 5内含子均未发现PCR-SSCP和PCR-RFLP 多态。 （3）牛 IGF-I 基因第 2 外显子与牛生长发育性状的相关性分析表明，该基因座 AA 型个体的体重、胸围显著高于 AB 和 BB 基因（P0.05）。 4. 牛 IGF-IBP3 基因第 2 外显子、第 3 外显子座位多态与牛生产性能的分析 （1）首次在牛 IGF-IBP3 基因的第 2 外显子发现 PCR-SSCP 多态，由于 8069bp 处碱 基 T→C 的突变，导致等位基因 A 变成等位基因 B，形成该位点多态。在三个牛群体 中等位基因 A 为优势等位基因，该座位处于 Hardy-weinberg平衡。 （2）牛 IGF-IBP3 基因第 3 外显子未发现 PCR-SSCP 和 PCR-RFLP 多态。 （3）IGF-IBP3 基因的第 2 外显子基因座位（即 IGF-IBP3-P5）是唯一影响鲁西牛头 部评分的位点，AA 基因型的个体头部评分显著小于 AB 和 BB 基因型（P0.05）。 WP=14 摘 要 iii 5. 基因型的组合效应对牛生长发育性状影响的分析 （1）通过 GH 基因第 5 外显子、3’端（即 GH-P3、GH-P4）位点不同基因型组合对 牛生产性状效应的分析，结果表明：GH-P3 和 GH-P4 位点存在非等位基因间的互作 效应，其组合效应值均高于 GH-P3 和 GH-