小鼠-山羊交互异种核移植研究

【摘要】：本实验在对小鼠卵母细胞激活及孤雌胚体外发育, 山羊卵母细胞体外成熟培养、激活及孤雌胚体外发育条件进行研究的基础上，分别以小鼠(山羊)颗粒细胞作为供核细胞，以山羊(小鼠)MⅡ去核卵母细胞作为受核细胞进行了异种核移植研究。得到如下结果与结论： 小鼠卵母细胞孤雌激活 以7%乙醇激活（6min,7min和8min）成熟的小鼠卵母细胞,将激活后的卵母细胞分别置入预平衡的培养液中（CZB、KSOM、M199）培养。结果发现：卵母细胞激活率随着激活时间的延长而提高,同时卵母细胞的碎裂率亦随之提高。7min和8min组卵母细胞激活率显著高于6min组(P0.05)，而7min和8min处理组差异不显著。因此小鼠卵母细胞激活时间以7min为宜。 离子霉素（5min）联合6-DMAP(3h,4h和5h)进行卵母细胞孤雌激活，将激活后的卵母细胞分别放入预平衡的培养液中（CZB、KSOM、M199）培养。结果发现:离子霉素联合6-DMAP可显著提高小鼠卵母细胞的激活率。随着激活时间的延长，碎裂率亦增加，说明激活时间以4h为宜。 用7%乙醇激活（7min）的卵母细胞在三种培养液（CZB，KSOM，M199）进行培养。结果表明，CZB中卵裂率最高（71.2%），其次为KSOM（65.4%）, M199(53.3%)最低,其中CZB与M199组间存在显著差异(P0.05)。在囊胚率发育方面，CZB组最高（23.8%）,而M199组(7.0%)最低,两者间存在显著差异(P0.05)。而KSOM组(17.1%)结果则介于二者之间。说明CZB作为小鼠激活胚培养液较为理想。 用离子霉素+6-DMAP激活(4h)的卵母细胞在三种培养液（CZB，KSOM，M199）进行培养，结果表明:在KSOM中卵裂率最高（82%）,其次为CZB（80%），M199(75.4%)最低，三组间无显著差异(P0.05)。在囊胚率发育方面，以CZB组为最高（32.5%）,而M199组(12.3%)最低,两者间存在显著差异(P0.05)。而KSOM组结果则介于二者之间(27.2%)。说明在离子霉素+6-DMAP激活条件下，CZB和KSOM均可用于小鼠激活胚体外培养。 山羊卵母细胞体外成熟培养 在基础培养液中（M199）添加5%、10% FBS或5%、10% EGS后，山羊卵母细胞的体外培养成熟率均得到显著提高，分别为66.2%,72.2%和68.8%,71.5%。说明添加血清对卵母细胞体外成熟有一定影响。 以M199+10%FBS为基础液，添加不同激素和因子(FBS,FSH,LH,EGF,HMG)后，山羊卵母细胞体外成熟率有所提高。说明添加激素和因子对卵母细胞体外成熟有利。 山羊卵母细胞孤雌激活 WP=8 在室温下(25℃)对山羊卵母细胞进行激活处理(3h,4h,5h),结果卵裂率分别为2.5%,4.2%和2.9%,无囊胚发育。说明温度激活不宜作为山羊卵母细胞激活的方法。 7％乙醇联合6-DMAP/6-DMAP-CB尽管可部分激活山羊卵母细胞，但囊胚发育率较低(0%～5.2%),因此, 亦不宜作为山羊卵母细胞激活的方法。 离子霉素(5min)联合 6-DMAP/6-DMAP-CB处理3～5h,可以获得较高的卵裂率和囊胚发育率, 尤其以离子霉素(5min)+ 6-DMAP-CB(4h)程序囊胚发育率最高(43.0%)。 小鼠-山羊异种核移植研究 在离子霉素+ 6-DMAP-CB激活程序中，激活时间对鼠-羊核移胚的卵裂率和囊胚率有很大影响。在卵裂率上，激活4小时效果最好，卵裂率最高(67.5%)，但与其它组间无差异显著性。在囊胚率发育上，激活3h(16.4%)和4h组(22.2%)显著高于5h组(8.6%)(P0.05)。说明，核移胚的最适激活时间以4h为宜。 将激活后的鼠-羊核移胚在含5%FBS mCR1aa或5%FBS mCR1aa + 颗粒细胞单层的培养液中培养，卵裂率(79.5%和77.4%)和囊胚发育率(15.3%和19.2%)均高于mCR1aa组的卵裂率(64.5%)和囊胚发育率(7.1%)。说明共培养系统对核移胚体外发育有利。 以小鼠颗粒细胞为供核细胞,山羊去核卵母细胞为受核细胞进行核移植。结果发现,鼠-羊胚的卵裂率为67.5%，囊胚发育率为24.1%,均低于羊-羊核移植的卵裂率(75%)和囊胚发育率(46.7%)。说明异种动物核移植并不完全等同于同种动物核移植。 山羊-小鼠异种核移植研究 以山羊颗粒细胞为供核细胞,小鼠去核卵母细胞为受核细胞进行核移植,结果发现,羊-鼠胚的卵裂率为52.5%，囊胚发育率为11.9%,但均低于鼠-鼠核移植的卵裂率(71.3%)和囊胚发育率(35.1%)。说明异种动物核移植并不完全等同于同种动物核移植。 不同培养液(CZB,CZB+GC;KSOM,KSOM+GC;M199,M199+GC)中,核移胚的卵裂率相似，但在囊胚发育率上存在显著差异，以CZB+GC组发育率最高(13.3%),M199最低(2.4%)。说明CZB+GC是山羊-小鼠胚体外发育的适宜培养系统。