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小麦对白粉病诱导抗性体系中蛋白质与基因的表达差异研究

陈鹏  
【摘要】:白粉病是小麦的重要病害之一,它是由专性寄生真菌—小麦白粉菌(Blumeria gramminis.DC.f.sp.tritici)引致。伴随以 Pm8 基因为主的小麦品种抗性的丧失,我国面 临小麦白粉病大流行的危险。后备抗源的缺乏,促使人们对控制小麦白粉病新方法进行 研究, 其中最为突出的是诱导抗性的利用。诱导引起的抗性变化实质是基因和蛋白质表 达变化的外在表现,分析诱导抗性中小麦基因和蛋白质表达的差异对于揭示小麦对白粉 病的抗性机理有重要意义。 本研究以感病小麦品种小偃 6 号为材料,测定了苯(1,2,3)噻二嗪-7-硫代羧酸-S- 甲酯(BTH)、β-氨基丁酸(BABA)、KCl、草酸和水杨酸(SA)对小麦白粉病的诱导 抗性作用。经过比较这几种诱导剂的诱导效果,确定 BTH 和 BABA作为小麦白粉病的 抗性诱导剂,并以 BTH 为诱导剂,首次较系统地从蛋白质和核酸两个方面对诱导抗性 进行了探讨,为揭示 BTH 对小麦白粉病的诱导抗性机理奠定了坚实基础。 研究结果表明:BTH和 BABA对小麦白粉病表现出较强的诱导抗性作用。0.4mmol/L BTH和 10mmol/L BABA在小麦三叶一心期喷雾处理都能诱导小麦叶片对白粉病的系统 抗性,其相对防效分别可达 60%和 50%左右,BTH 和 BABA叶面喷雾与接菌间的最适 时间间隔分别为 2 天和 2-4 天。0.4mmol/LBTH 和 10mmol/L BABA分别处理小麦幼苗 的第一、二叶,通过对第三叶的过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质 内切酶、几丁质外切酶和β-1,3,-葡聚糖酶活性变化的研究,结果表明,BTH、BABA或 接种白粉菌都可诱导上述防御酶活性不同程度的升高,说明小麦对外源 BTH 和 BABA 的反应与对病原菌侵染的反应相似,诱导处理可产生系统的信号形成小麦对白粉病的系 统获得性抗性,防御酶活性的提高与诱导抗性的表达密切相关,可能直接参与了抗性的 表达,BTH 和 BABA处理的小麦叶片防御酶活性高低及出现的峰值不同,推测 BTH和 BABA 诱导产生的抗病机制可能不完全相同。在实验中建立了胶态几丁质制备的新方 法,对该方法正在专利申请中。 WP=7 对 BTH处理后 4 天的小麦叶片胞内蛋白和胞间隙蛋白进行提取,利用 SDS-PAGE 分析,结果表明 BTH 处理和接种都会诱导叶片胞间隙 4 种新蛋白的合成和 1 种蛋白含 量的大大增加,而胞内蛋白的表达与对照植株无差异。利用制备性电泳,结合 KCl负染 和电洗脱的方法,回收纯化三种胞间隙液表达的诱导蛋白,其中两种蛋白经 SDS-PAGE 分析显示为单一条带,分子量分别为 19.2kD 和 35.7kD。该结果为诱导蛋白的抗体制备 和探讨病程相关蛋白的表达和功能奠定了坚实的基础。 利用抑制性消减杂交技术对BTH诱导抗性植株与未诱导植株接种96小时基因表达 差异进行分析,以 BTH 诱导处理并接种的植株为 tester,以未经 BTH 处理的接种植株 为 driver,通过 RNA提取、反转录、ds cDNA、RsaⅠ酶解、接头连接、液相杂交和巢 式 PCR 获得差异表达的基因片断,将差异的片断克隆到 pGEM T easy 载体上 (Promega),转化 E.coil DH5α,获得抑制性消减文库,共获得约 1200 个转化克隆, 对 42 个克隆进行测序,经 Blastn与小麦 EST 库进行比较,有 16 个克隆未找到同源序 列。有两个克隆与蚜虫诱导的 EST 有高度的同源区。取六个克隆进行 Northern 杂交分 析,有三个克隆为差异表达的序列,包括 2 个蚜虫诱导的 EST。3 个克隆在 tester和 driver 中均未出现杂交信号,推测可能是表达水平极低的基因。这些结果说明,BTH 诱导的抗 性植株与未经诱导的植株在接种后的基因表达谱存在差异,差异表达的基因是 BTH 诱 导的新基因,还是病原侵染后表达受抑制的基因,有待进一步研究。该研究为揭示诱导 抗性的机理、植物抗病性与抗虫性信号途径的交谈和克隆全长抗白粉病相关基因奠定了 基础。


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