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草酸氧化酶基因转化烟草和油菜的研究

景岚  
【摘要】:油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)是世界范围的主要病害。在中国,油菜菌核 病居油菜三大病害之首,严重影响了我国的油菜生产。近年来,随着基因工程技术的发 展以及油菜转化体系的建立,许多学者通过基因工程的手段研究油菜的抗病性。菌核病 菌能侵染 400 多种植物。根据它致病的关键因子去寻求控制策略是最根本的途径。由于 它产生高度致病因子—草酸,因此引入编码草酸降解酶的基因来获得对分泌草酸病原真 菌的抗性是一个极具前途的方法。为研究草酸氧化酶基因(Oxalate oxidase gene,OxO) 对植物抗病的作用及获得抗菌核病油菜植株,本研究以烟草(Nicotiana tabacum)和甘 蓝型油菜(Brassica napus)为试材,将来自于小麦的草酸氧化酶基因进行了农杆菌遗传 转化,主要工作及结果如下: 1. 适宜农杆菌转化体系的建立 以烟草(Nicotiana tabacum)“97131” 和甘蓝型油菜(Brassica napus)常规品种 “01701”为材料,选用烟草叶片,油菜下胚轴作为转化受体,建立了适宜的农杆菌转 化体系。 通过对各种影响因素的分析,最终确定烟草转化再生系统中最适培养基为: I.分化培养基:MS + 4 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA, pH 5.8 II.筛选培养基:分化培养基 + 100 mg/LKm(卡那霉素)+ 500 mg/LCb(羧苄青霉素), pH 5.8 III.生根培养基:1/2 MS + 2 mg/L IBA + 100 mg/LKm + 300 mg/L Cef(头孢霉素), pH 5.8 油菜转化再生系统中最适培养基为: I.预培养基:MS + 1 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L 6-BA II.分化培养基:MS + 4 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA, pH 5.8 III.筛选培养基:分化培养基 + 25 mg/LKm + 500 mg/LCb + 6 mg/L AgNO3,pH 5.8 IV.生根培养基:1/2 MS + 2 mg/L IBA + 20 mg/LKm + 300 mg/L Cef,pH 5.8 2. 卡那霉素抗性苗的获得 用对数分裂中期 OD600 为 0.3~0.4 左右时的农杆菌菌液稀释 3~5 倍侵染 3~5 min。 通过与农杆菌的共培养,经卡那霉素筛选,得到烟草卡那霉素抗性苗 15 株,油菜卡那 霉素抗性苗 7 株。 i WP=6 3. 抗性苗的 PCR 检测 利用特异引物对抗性苗进行 PCR 检测,15 株烟草卡那霉素抗性苗中的 14 株,7 株 油菜卡那霉素抗性苗中的 3 株表现阳性,扩增出与阳性对照一致的 470 bp 的片段。 4. PCR 扩增产物的序列测定 将 PCR 扩增产物连接到 PGEM?-T Easy Vector 上进行序列测定,测序结果与草酸氧 化酶基因进行比对,序列相似性均达到了 100%,证实草酸氧化酶基因已整合到了烟草 和油菜的基因组中。  5. 抗性测定 对所获得的烟草和油菜转基因植株用不同浓度草酸处理,与对照植株相比转化植株 明显提高了对草酸的耐受性。实验证实草酸氧化酶可提供植株对分泌草酸真菌的抗性。 由于草酸处理与油菜受到菌核病菌侵染时的表现高度一致,所以草酸氧化酶基因的引入 和表达可以明显提高油菜对菌核病的抗性。


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