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小鼠早期转基因胚胎体外培养与鉴定的研究

赵永贞  
【摘要】:本研究以SPF级昆明小白鼠为实验动物,探索了对早期转基因胚胎进行移植前筛选的方法。通过对早期胚胎套皿培养法的检验、几种培养液的筛选和改良,以及对猪输卵管上皮细胞共培养系统可靠性的分析,建立了稳定的小鼠早期胚胎体外培养系统。在此基础上,研究了显微注射和获取受精卵的时间对早期转基因胚胎体外发育的影响,以及人血清白蛋白基因在小鼠早期转基因胚胎中的滞留情况,得出如下结果: 1.研究了单皿法和套皿法对小鼠早期胚胎体外发育的影响,发现培养在微滴没用液体石蜡覆盖的单皿中的胚胎无一例发育到4-细胞阶段,而培养在微滴用液体石蜡覆盖的单皿中的胚胎有36%发育到囊胚期;采用套皿法进行胚胎培养,在微滴上覆盖液体石蜡和不覆盖液体石蜡皿中胚胎的囊胚发育率分别为54%和57%,二者差异不显著(P0.05);比较套皿法和单皿微滴覆盖法培养胚胎的效果,结果表明套皿法培养胚胎的囊胚率显著高于单皿微滴覆盖法(P0.01),从而证明,套皿法是一种有效的早期胚胎体外培养方法。 2.比较研究了小鼠早期胚胎在培养液WM、mWM、CZB和TE中的发育情况,发现mWM、CZB和TE都能有效克服昆明小鼠早期胚胎发育阻断,用培养液TE、mWM和CZB培养胚胎的囊胚发育率分别为76%、45%和52%,其中培养液TE的囊胚发育率显著高于mWM和CZB(P0.01)。以WM为基础培养液,比较不同浓度的葡萄糖与2.5mmoL的牛黄酸联合使用培养小鼠早期胚胎的效果,结果表明0.1mg/mL浓度的葡萄糖与2.5mmoL的牛黄酸联合使用培养胚胎效果最佳,可使78%的受精卵发育到囊胚。用等量的果糖代替培养液mWM中的葡萄糖,所形成的培养液mWM3能使82%的胚胎发育到囊胚期。 3.采用猪输卵管上皮细胞与小鼠受精卵共培养,取材于相同时期的输卵管上皮原代细胞和传代细胞单层获得的囊胚率之间差异不显著(P0.05);无论是原代细胞还是传代细胞,在猪受孕初期取材的输卵管上皮细胞单层获得的囊胚率极显著高于在猪发情间期取材的输卵管上皮单层(P0.01)。 4.实验证明在hCG注射后24~26h之间获得的受精卵,在原核显微注射人血清白蛋白基因后体外培养,有45%注射胚发育到囊胚阶段,而在18~22h仅有20%,二者差异显著(P0.05)。 5. 比较原核注射人血清白蛋白基因胚和非注射胚在各阶段的发育发现,以1-细胞 WP=9 胚胎数量为参数,非注射胚发育率显著高于注射胚(P0.05);但以2-细胞胚胎数量为参数,二者在各阶段的发育率差异不显著(P0.05)。这说明显微注射是引起受精卵卵裂率下降的主要原因之一,但并不显著影响显微注射胚2-细胞以后的发育。 6.采用PCR法对发育到各阶段的转基因胚胎检测发现,随着胚胎的发育表现为阳性胚胎的比率逐渐下降,其中2-细胞为96%,4-细胞为63%,8-细胞为43%,囊胚为19%。


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