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防治根结线虫的原核生防菌的筛选及作用

茆振川  
【摘要】:根结线虫(Meloidogyne spp.)是一种主要的植物寄生性线虫,每年给农业造成严重的损失。根结线虫的原核生防菌(细菌及放线菌),具有多重防治根结线虫机制,防治效果高,周期长,对环境、人畜及益虫安全,适合于绿色环保型农业发展的需要。根际细菌及放线菌已经成为防治根结线虫的研究热点。 在研究中,首先进行供试线虫培养,在室内用灰葡萄孢菌(Borytis cinerea)培养松材线虫 (Bursaphelenchus xylophilus ),在28℃下恒温培养5d线虫数量可以达到1400条/cm2。在清水中松材线虫可以存活7~12 d(1条/ul),且12 h内线虫的自然死亡率小于5%。采用液滴法,以Abamectin(1.8%AVM. B1)的1000倍稀释液的处理供试线虫,确定以处理30~45 min线虫的击倒率达到57.7%~76.9%为室内的筛选指标。在温室中,采用盆栽法确定418#菌株为温室筛选对照。 从全国采集32个土壤样品,分别为植物寄生性线虫病害土壤和自然土壤,用等比稀释平板法,以高氏1号培养基和牛肉汁蛋白胨培养基分离出放线菌960株,细菌346株。通过在室内以松材线虫为供试对象,采用液滴法进行初步筛选试验,温室中以根结线虫为供试对象,采用盆栽方法进行复选,共筛选出六个菌株,它们可以有效的杀死线虫,明显的减少根结数量。B24-14菌株、G21-31菌株培养液在45min 时对线虫的击倒率分别为95.4%、84.5%,在温室试验中分别使根结减少75.0%、67.3%。B24-14菌株、G21-31菌株在防治根结线虫,促进植物生长方面效果显著优于418#菌株及abamectin(1.8%AVM. B1)。 通过经典的分类方法、化学分类方法和16SrDNA方法相结合,对筛选出优秀的细菌和放线菌菌株进行分类鉴定。经鉴定菌株G10-16为链霉菌属弗氏亚群亚群(Streptomyces Fradiae);菌株G21-31为链霉菌属蓝色亚群(Streptomyces Gyaneus);菌株G21-33为链霉菌属黄色亚群(Streptomyces Flavus);菌株B22-3、菌株B24-14为芽孢杆菌属苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)。 对B24-14菌株的防治作用机制研究中,采用乙醇分级沉淀法并结合紫外分光检测,从B24-14菌株的培养液中分离出β-外毒素,并通过液滴法及细胞培养板法试验,证明β-外毒素(4mg/ml)在8h时线虫的杀死率可以达到93.75%。采用离心法制得伴孢晶体,并用蛋白晶体碱解液将其降解为可溶性的小分子蛋白,经试验伴孢晶体蛋白(1.6mg/ml)在16h时对线虫的杀死率为66.4%。采用AgNO3检测方法,证明B24-14菌株在培养过程中可以产生氨和其水溶性前体,且在室内有很高的杀线虫活性,可以在45min内100%的杀死线虫。通过室内的液体栽培方法,证明了B24-14菌株可以产生影响植物生长的物质,这种物质可以在高浓度下明显抑制植株生长,在低浓度下显著的促进植株的生长。


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