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鸡传染性支气管炎病毒陕西地方株的分离鉴定及S1基因的克隆和序列分析

倪斌  
【摘要】:近几年来,传染性支气管炎(IB)在陕西各地鸡场常有发生,给养禽业生产造成了巨大的损失。为了及时、准确的掌握该疫病发生发展规律,有效地对其进行控制,本研究开展了对陕西地区鸡传染性支气管炎病原的分离鉴定等工作。 采集陕西省宝鸡市、扶风县、兴平市和榆林市等地鸡场疑似传染性支气管炎发病鸡病料,通过9~11 日龄非免疫鸡胚进行了病毒的实验室分离和传代,并对分离毒株进行了病毒的血凝性、血凝抑制性、致病性、鸡胚矮小化、电镜特征等生物学特性鉴定,结果表明,4 株分离株经1%胰酶处理后的各代病毒尿囊液均可凝集鸡红细胞,标准阳性血清可特异性的抑制其凝集性,回归试验可复制出与自然发病相同的病例,病毒传代物有明显的致鸡胚矮小化作用,透射电镜下可见有近似球形、直径100 nm左右的冠状病毒粒子,将分离鉴定的4 株IBV 定名为BJ-04、FF-04、XP-03 和YL-04。 参考GenBank 中已发表的IBV 序列,针对S1 基因设计了3 条特异性引物,提取病毒RNA,用RT-PCR 方法均扩增到长约1.8kb 的特异目的片段;PCR 产物纯化回收后,与pMD18-T 载体连接,将重组质粒转化E. coli DH5a;经Amp+的培养基培养并挑出单克隆菌落;采用碱裂解法小量提取质粒,并用BamHⅠ, Hind Ⅲ双酶切法和质粒PCR 进行阳性筛选;取阳性质粒DNA进行测序。将所测定的分离株S1 基因核苷酸序列通过互联网提交到NCBI 中nucleotide-nucleotide BLAST 进行检索以及与GenBank 中注册的核苷酸序列进行比较;利用DNAStar 5.0 软件对分离株和M41、T 等已知序列毒株进行核苷酸及氨基酸序列同源性分析,绘制进化树,推测分离株与参考株之间的遗传距离;并对分离株S1 蛋白亲水性、抗原位点和糖基化位点等特性进行了理论上的分析;结合S1 基因酶切位点分析,可知在变异形式上,4 个毒株S1 基因均存在碱基的置换、插入与缺失;在进化关系上,FF-04 和XP-03 S1 基因同源性最高,亲缘关系最近;BJ-04 和YL-04 S1 基因同源性较高,亲缘关系较接近;4 个分离株S1 基因较呼吸型和肾型标准株S1 基因同源性均较低,亲缘关系较远,而且其基因型均为变异型。本研究丰富了IB分子流行病学资料,为IB 的诊断和预防奠定了良好的基础。


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