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大豆疫霉的分子检测及游动孢子多样性研究

陈长卿  
【摘要】:由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)引起的大豆疫病是大豆生产上毁灭性病害之一。该病是我国A1 类进境植物检疫对象,也是内检对象。随着我国的进一步对外开放和加入WTO 后国际贸易往来的增加,每年进口的大豆数量也在增加,大豆疫霉随之传入的风险越来越大。目前, 对大豆疫霉检测常用一些传统方法,但这些方法在应用过程中都存在特异性弱、假阳性、耗时长,准确率低等缺点和不足。因此,建立一套准确、稳定、快速的检测体系已刻不容缓。本试验拟根据大豆疫霉核糖体内转录间隔区(ITS)序列,设计特异性引物,建立PCR 检测体系,为我国的大豆疫霉检验检疫提供理论基础和技术方法。本研究主要取得了以下成果: 1. 利用通用引物ITS1/ITS4 PCR扩增了大豆疫霉和辣椒疫霉ITS序列,经序列同源性分析,选取大豆疫霉保守序列,设计了大小分别为20bp、21bp的特异性引物PS1/PS2。 2. 对大豆疫霉的PCR 反应条件进行了优化,筛选出适用于检测大豆疫霉的标准化PCR 反应体系:10×Buffer(750 mmol·L~(-1) Tris-HCl, 200 mmol·L~(-1) (NH4)2SO4, 0.1%Tween20)2.5μl, MgCL2 (25mmol·L~(-1)) 2.0μl,dNTP (2.5mmol·L~(-1)) 1.5μl,引物PS1/PS2(20 ng·μl~(-1))各2.0μl,Taq 酶1U,模板DNA (20 ng·μl~(-1)) 1μl,加ddH2O 至25μl。反应循环参数是:94 ℃3min,94 ℃50s,59.8 ℃40s,72 ℃1.5 min, 35个循环, 72 ℃7 min。重复扩增试验证明该反应体系的特异性高,稳定性好,对大豆疫霉菌丝体和土壤中卵孢子检测的灵敏度可达到10-5ng·μl~(-1) 和0.05 个卵孢子·g~(-1) 土壤。 3. PCR 检测体系对含有大豆疫霉的病残体和土壤进行了应用检测试验,结果证明该体系的检测效率较高,可以用于大豆疫霉的分子检测。 合理利用寄主抗病性是防治大豆疫病最为经济有效的措施,然而大豆疫霉新小种的不断产生和发展常常导致大豆抗病性丧失。长期以来, 人们对大豆疫霉的遗传和变异,包括无性和有性世代的分化以及遗传多样性等方面进行了大量的研究,但未见有大豆疫霉同一孢子囊游动孢子多样性的研究报道。因此,本试验拟通过对来源于大豆疫霉同一孢子囊的游动孢子多样性的研究,以期揭示大豆疫霉无性后代的遗传多样性及多样性产生的遗传学基础。本研究主要取得了以下成果: 1. 成功分离了三个大豆疫霉单游动孢子囊,并诱导游动孢子释放,建立了共95 个单孢菌系。 2. 研究了单孢分离物菌落形态和菌丝生长速率。结果表明,菌落形态和生长速率在单孢菌系间和与亲本间无显著差异。 3. 采用下胚轴伤口接种法分别对来源于两个孢子囊的32和35个单孢分离菌株进行了


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