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草酸氧化酶基因转化杨树的研究

张岗  
【摘要】:杨树(Populus spp.)是人工防护林的重要树种之一,在国民经济生产中起着其他树种所无法比拟的作用。一直以来,杨树因受病害威胁每年给国民经济造成的损失不可估量,而给生态环境造成的巨大破坏更是无法弥补的。利用基因工程技术对杨树进行抗病性遗传改良育种是切实可行的方法。 草酸作为真菌分泌的毒素并参与致病,目前已在核盘菌属等10 个属中有报道。利用草酸降解酶的转基因植物来获得对分泌草酸病原真菌的抗性是一个极具前途的方法。而且,分解草酸所产生的H2O2 对病菌侵袭的早期反应,信号转导途径中调节过敏性坏死反应以及激活植物防御基因表达等抗病反应过程中都发挥着重要作用。 本研究利用根癌土壤杆菌介导的叶盘法将来自小麦的草酸氧化酶基因(Oxalate oxidase, OxO)转入优良杨树树种,以获得对多种病原真菌有“广谱抗性”的转基因杨树。所用工程菌为LBA4404,双元植物表达载体为OxO-pGPTV-KAN,其上含有OxO基因gf2.8,卡那霉素(Kanamycin, Kan)抗性标记基因(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因,nptII)。选用抗逆性较强、广为种植的84K 杨(Populus alba ×Populus gllandulosa)和三倍体毛白杨(Populus tomentosa Carr.)作受体材料。具体研究内容如下: 1. 建立了84K 杨叶盘外植体高效再生系统。首次将2,4-D 同时用于杨树组织培养中的愈伤组织诱导和芽分化,筛选出最佳84K 杨叶盘外植体最佳不定芽诱导培养基配方为:MS + 0.02 mg/L 2,4-D + 1.0~1.5 mg/L 6-BA;叶盘诱导率高达90%~100%;每叶平均诱导芽数多达20 个左右。 2. 通过腋芽分化获得三倍体毛白杨无菌苗,并建立了三倍体无菌苗的扩繁体系。筛选出适宜三倍体毛白杨叶盘不定芽分化的培养基为1/2 MS + 0.75 mg/L 6-BA + 0.01 mg/L NAA + 20 g/L蔗糖;叶盘诱导率为60%左右;每叶平均诱导芽数为3~4 个左右。 3. 进行了84K 杨和三倍体毛白杨的卡那霉素敏感性测定。确定了84K 杨和三倍体毛白杨叶片芽诱导卡那霉素临界筛选浓度分别为20 mg/L和15 mg/L;并确定了两者芽生根卡那霉素临界筛选浓度分别为20 mg/L 和15 mg/L。 4. 摸索了根癌土壤杆菌介导的叶盘法转化杨树的各种影响因素。基本确定适宜的转化路线为:诱导培养基上叶盘预培养2~3 d → OD600 约为0.5 稀释的菌液中侵染5~10 min → 诱导培养基上共培养4~5 d(暗培养) → 脱菌处理10 d 左右(诱导培养基附加适量浓度的头孢霉素或羧苄青霉素) → 选择性生根培养基(生根培养基附加适量浓


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