利用16S rDNA序列分析鉴定油菜内生细菌研究

【摘要】：植物内生细菌(Endophytic bacteria)是指定殖在植物组织内部但不引起明显病害症状的细菌。内生细菌对其宿主具有许多生物学作用,例如促进植物生长、抵抗病虫害侵袭等,因而植物内生细菌概念提出的时间虽然较短,但已引起了多学科科学家们的广泛关注。油菜是重要的油料作物,在油菜的生育期中受到多种病害的为害,给油菜的生产带来很大损失。本研究通过对油菜内生细菌的系统鉴定及其一些有益生防菌的筛选,为今后进一步研究油菜内生细菌的种群多样性及有效利用油菜内生细菌作为生防因子奠定基础。　 本试验从健康油菜植株的不同组织器官中分离到大量内生细菌,这些细菌菌落形态存在明显的差异,表明油菜组织中存在大量内生细菌,且类群丰富。分离获得的122株内生细菌,根据菌落形态可以划分为35类;利用细菌通用引物对16S核糖体DNA进行扩增,　获得约1.5　kb片段,分别用内切酶HaeⅢ和MspⅠ对扩增产物进行限制性酶切,产生不同的酶切图谱;根据酶切图谱聚类分析结果,所有供试菌株被归为39类,这一结果从遗传上显示油菜内生细菌类群的多样性。两种方法获得的归类结果经过比较,发现菌落特征所反映的信息量是有限的,只能作为初步的参考指标,核糖体DNA的限制性片段长度多态性分析快速、准确,可以作为油菜内生细菌多样性分析的一种有效方法。　通过平板对峙培养法测定122 株内生细菌对十字花科黑斑病菌、油菜菌核病菌等10 种植物病原真菌的抑菌作用,结果表明有22 株内生细菌对一种以上的病原菌具有抑菌作用,其中5 株(G5、BS5、B5、J6、LT20)抑菌谱广,抑菌作用明显;进一步测定了这5 株内生细菌的无菌滤液对10 种病原真菌的抑菌率,结果发现,这5 株拮抗菌的发酵液对病原真菌均有不同程度的抑菌效果。本研究显示从油菜内生细菌中可筛选到拮抗作用好的菌株,并且内生细菌可产生具有抑菌活性的代谢物,可以作为对多种植物病原真菌具有抑菌活性物质的筛选资源。通过16S　rDNA 序列系统发育分析,5 个菌株分别被鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、乙酸不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticu)、成团肠杆菌(Pantoea agglomrans)、恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)、成团泛菌属(Pantoea ananas),作为内生细菌存在于油菜体内属首次报道。　 通过16S　rDNA 序列系统发育分析对PCR-RFLP 划分的主要类群进行了鉴定,共鉴定出内生细菌16 种,分别是,分别为:蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、泡状枝动菌(Mycoplana bullata)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、鲍氏不动杆菌(A.