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透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的大肠杆菌融合表达载体的构建与表达分析

吴迪  
【摘要】:生物素(Biotin)是生物机体内主要代谢过程所必需的生长因了之一,对生物生理具有不可替代的作用。它在畜牧业、分子生物学,生物发酵及医药行业等领域应用广泛。由于生物素不能直接从自然界获得,通常化学合成的方法得到。由于化学合成生产工艺复杂,难提纯,成木高,导致生物素价格居高不下。 随着生物发酵工业的发展,以及核黄素(V_(B2))生物合成的产业化应用,生物素合成方法逐渐由化学合成转向生物合成。但是在工业发酵过程中的溶氧问题,严重地制约着生物素的大量生长以及纯化的瓶颈。因此鉴于透明颤菌血红蛋白能提高发酵环境中的氧的含量,本研究旨在构建含有vgb基因的大肠杆菌融合表达载体,然后利用金属离子(Ni2+)配体亲和层析并经过高浓度洣唑洗脱,得到高纯度的透明颤菌血红蛋白,为构建发酵工程菌提供更多的数据,进一步解决工业发酵生产生物素溶解氧的问题,提高生物素的产量和其纯度。 在研究中,我们首先为了便于基因工程操作,在引物两端分别加上EcorI和XbaI两个酶切位点,利用PCR技术将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)克隆到含有His_6亲和蛋白标签融合表达载体PET28A,在大肠杆菌BL21(DE3)表达。对表达条件优化,结果显示:重组蛋白在30℃诱导获得可溶性表达,IPTG终浓度为2.5MM条件下诱导表达,透明颤菌血红蛋白的表达量占菌体总蛋白的27.7%,用SDS-PAGE电泳进行检测,明显看见目标带。对重组的透明颤菌血红蛋白进行Ni2+亲和层析纯化,重组蛋白可见光区400NM波长处有强吸收峰,表现血红蛋白同样的性质。对纯化的透明颤菌血红蛋白进行分子筛选,记录纸上共出现两个峰,第一个峰明显比第二个峰高,第一个峰对应的是透明颤菌血红蛋白的二聚体,第二个峰应的是透明颤菌血红蛋白的单聚体。


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