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siRNA干扰TMV侵染及其分子机理的研究

赵明敏  
【摘要】:RNA 干扰(RNA interference,RNAi)是与内源性mRNA 编码区某段序列同源的双链RNA 导入细胞后,该mRNA 发生特异性降解,从而导致该基因表达沉默的现象。被认为是植物在进化过程中发展出的一种非常古老的抵抗外来基因(病毒、转座子等)入侵的防御方式。21nt 的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)作为RNAi 途径的重要中介,已被广泛应用于哺乳动物和人细胞体系中基因功能和抗病毒研究,但在植物抗病毒研究中应用较少。  根癌农杆菌介导的瞬时表达系统已广泛用于非转基因植物的基因功能研究,它不仅可以快速地导入外源基因,而且使转入基因在短时间内表达。它的另一个特点是可以在一个叶片组织中同时导入多个基因。由于上述优点,这一研究技术将在功能基因组学和蛋白组学研究中发挥更大的作用。  烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是正单链RNA 病毒,是典型的模式植物病毒。研究清楚RNA 干扰在植物抗TMV 上的作用,可以带动其他病毒的相关理论问题和应用实践研究。因此,本文以烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)基因组为靶位,设计合成表达小干扰RNA 的寡核苷酸,亚克隆到植物双元表达载体pBI121 中,直接转化根癌农杆菌EHA105。通过根癌农杆菌介导的瞬时表达法,研究了靶向TMV 复制酶基因(126kDa 蛋白)、外壳蛋白基因、和运动蛋白基因的siRNA 对TMV 侵染的干扰作用。实验得到以下结果:  1. 成功构建了在植物体内表达靶向TMV 复制酶基因(126kDa 蛋白)、外壳蛋白基因、运动蛋白基因的siRNA 重组表达载体。  2. 瞬时表达靶向TMV 复制酶基因(126kDa 蛋白)的siRNA 能干扰TMV 侵染。接种病毒14d 后,所有pBI/siRNA1519- 和pBI121 空载体处理的烟草上部叶片出现了TMV 侵染的典型花叶症状,而83%的pBI/siRNA1519 和85%的pBI/siRNA2129 处理的烟草上部叶片无任何症状产生。Northern 杂交结果也表明siRNA1519 和siRNA2129 处理的叶片TMV RNA 水平显著降低,或者未检测到RNA 积累。相反,pBI121 和 pBI/siRNA1519- 的处理有较丰富的RNA 积累。随机突变5 个碱基的处理和阴性对照一样不能够抵抗TMV 侵染。表达TMV 复制酶基因的siRNA 处理接种异源病毒(CMV)后也不能抵抗异源病毒侵染。这表明siRNA 介导的干扰作用具有序列特异性和时间、位点依赖性。  3. 瞬时表达靶向TMV 外壳蛋白基因的siRNA 能干扰TMV 侵染。含有重组表达载体


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