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苏去金杆菌的分离、cry/cyt基因鉴定及杀线虫活性的研究

罗兰  
【摘要】:农业有害生物每年都对农作物的生产造成严重的损失,尤其是鳞翅目、鞘翅目、双翅目等害虫及植物病原真菌、寄生线虫等的危害最为严重。苏云金杆菌制剂是目前应用最为成功的一类微生物杀虫剂,在防治植物病害方面也取得了一定的进展。深入挖掘我国丰富的苏云金芽孢杆菌资源,分离克隆新型高毒力的杀虫蛋白基因,对构建高效广谱工程微生物和培育转基因抗虫植物具有重要的理论意义和应用价值。 本研究从我国20 省市自治区共采集178 份土样,采用常规稀释平板法,并结合伴孢晶体的复红染色鉴定苏云金杆菌,共分离获得苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)51株。对51 株Bt 分离菌株的cry 基因进行了PCR 鉴定。以cry1,cry2,cry3,cry4,cry-n,cry7,cry8,cry11,cry13 和cyt 的通用引物作PCR 分析,研究结果表明:4 株含有cry4,12 株含有cry7,4 株含有cry8,4 株含有cry1,2 株同时含有cry1 和cry2,27 株无PCR产物,未检测到其它基因型。 对4 株含有cry4 菌株进行了系统研究。结果表明:编号为BD-2-1,BD-2-2,HC-7-1和STG-21-7 的Bt 菌株主要形成球形伴孢晶体,部分为不规则形;前3 个菌株的11 项生理生化指标基本一致,但与STG-21-7 差别较大;这4 个菌株活性晶体蛋白主要由66~72kDa、27~31kDa 和20kDa 组成;从cry4 基因序列同源性分析认为,BD-2-1 和BD-2-2 为同一菌株,与另外2 株有差异,但4 菌株所含基因的同源性大于90%,都与cry40-like 同源性为88%。 对4 株含有cry8 菌株进行了系统研究。编号为YN-1-1、SH-1-2、HZJ-35-17 和HZJ-3-3 的菌株主要形成扁长方形伴孢晶体,部分为不规则形;11 项生理生化指标差别较大;HZJ-35-17 的杀虫晶体蛋白主要为130kDa 和70~75kDa,其它菌株的杀虫晶体蛋白主要为70~75 kDa;从cry8 基因序列同源性分析认为,YN-1-1、SH-1-2、HZJ-35-17和HZ-3-3 的同源性大于90%; YN-1-1 与SH-1-2 所含cry8 基因的同源性高达99.67%;HZJ-3-3 所含cry8 基因和cry8Bb1 基因同源性达97%;HZJ-35-17 和YN-1-1 及SH-1-2的同源性为95%,这4 株所含基因与cry8B的基因同源性为89%,和cry8A 基因的同源性为83%。   用51 个苏云金杆菌菌株对松材线虫进行了活性测定,筛选到2 株活性较高的苏云金杆菌,(其编号分别为XZ-4-5 和HC-7-1)分别提取外毒素和内毒素对松材线虫生测,明确了活性物质主要是外毒素,内毒素活性不如外毒素高。通过温室盆栽试验,结果表明,2 个菌株对番茄根结线虫(Meloidogyne spp)均有一定的防效。 菌株XZ-4-5 的外毒素对松材线虫有一定的活性,且含有对鞘翅目害虫有活性的cry7 基因,这对进一步研究其对松材线虫或其传播介体松褐天牛的杀虫活性具有重要


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