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棉铃虫细胞色素P450基因的克隆与表达

马彩霞  
【摘要】:细胞色素P450 单加氧酶系是一类广泛分布于生物有机体中的重要酶系,它能够代谢多种内源性物质和外源性物质,因其生物学的重要性,一直是生物学领域研究的一个重要对象。棉铃虫Helicoverpa armigera 是一种在世界范围内普遍发生的重要害虫,能导致多种不同作物的严重损失。为深入了解棉铃虫细胞色素P450 的结构与功能,我们就棉铃虫细胞色素P450 基因的克隆及异源表达开展了研究,主要研究结果如下:  根据细胞色素P450 血红素结合区的保守序列,设计了8 条P450 特异性引物,应用基于mRNA 差异显示(mRNA differential display RT-PCR)的基因分离技术,从6 龄实验室品系棉铃虫中肠组织中成功克隆了一条在棉铃虫中肠组织中表达的细胞色素P450 基因的EST(Expressed Sequence Tag)片段。该片段长324bp,包括细胞色素P450的保守序列F--G---C-G,及完整的3′非编码区,其中编码区长197bp,编码67 个氨基酸残基,完整的3′非编码区长127bp,在poly(A)尾上游-25bp 处存在一AATAAA 加尾信号。  利用5′RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术,以EST片段的序列信息为基础,设计特异引物GSP与通用引物AUAP扩增该EST的5′端,对5′RACE产物进行了克隆和测序。测序结果表明:5′RACE片段长1605bp,并在5′端存在起始密码子ATG和部分或全部5′非编码区,其中3′端的PFGFGPRNCIG序列和EST序列完全一致。进而对EST序列和5′RACE片段的序列进行拼接,从而获得该细胞色素P450 cDNA的全长序列信息。结果表明:该cDNA全长为1893bp,其中5′非编码区长173bp,编码区长1593bp,编码一个由531个氨基酸残基组成的蛋白质,3′非编码区长127bp。用有关生物学软件对该蛋白质进行预测,该蛋白质分子量为61kDa,等电点为8.30,并且在N-基末端存在一高疏水的信号肽序列,这个特点是所有真核生物微粒体细胞色素氧化酶的共同特点。该cDNA序列已登录GenBank数据库,登录号为:AY753201,并由D.Nelson 命名为CYP9A17。CYP9A17分别与来源于棉铃虫的CYP9A12、CYP9A14、烟芽夜蛾的CYP9A1、德国蜚蠊的CYP9E2、小菜蛾的CYP9G2和冈比亚按蚊的CYP9L1的氨基酸序列相似性为:93%、62%、54%、42%、40%和38%。  根据CYP9A17 cDNA的全长序列信息,合成代表CYP9A17 cDNA 5′和3′两编码区末端的引物,运用RT-PCR方法,直接从棉铃虫cDNA库体外扩增棉铃虫CYP9A17 编码区cDNA的拷贝。该编码区cDNA拷贝被克隆进pGEM-T easy载体。测序结果证明,已成功构建了棉铃虫细胞色素P450 CYP9A17编码区的cDNA克隆,为进一步研究该基因的结构、功能和调控创造了便利的条件。


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