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猪瘟Shimen株致猪血管内皮细胞病变前后表达差异基因寻找及E2基因PK-15细胞表达

张永国  
【摘要】:猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪急性高度接触性传染性疾病,是严重威胁养猪业,具有重要经济意义的病毒性疾病之一,猪瘟可引起猪的全身组织器官弥漫性出血,小血管和毛细血管内皮细胞发生变性、坏死。猪瘟病毒为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员,基因组大小约12.3kb,含一个大的开放阅读框(ORF),由11 个编码结构蛋白与非结构蛋白的基因组成。 猪瘟病毒对血管组织具有亲嗜性,病理组织学检查时发现,组织器官的出血斑点主要是由于小血管和毛细血管内皮细胞发生肿胀、变性和坏死;梗死灶的发生主要是由于小动脉管内皮细胞发生变性、坏死、剥脱后,血管内膜粗糙,官腔内血栓形成,导致官腔狭窄或闭塞所致。此外,还可见到心肌呈实质变性,但病猪的肾脏等器官的实质细胞没有变性、坏死等病理变化。而目前在体外增殖猪瘟病毒利用的培养细胞大多数是猪肾细胞(如PK–15、PK–2a、SK–6等),其他还有猪肺、脾、睾丸、骨髓细胞等。这些细胞即使在猪瘟病猪体内都不会发生病理变化,所以在体外受CSFV 感染时不产生CPE也是理所当然的。病理组织学观察发现猪血管内皮细胞在猪瘟感染猪后发生明显的细胞病变,建立猪血管内皮细胞体外培养方法,观察猪瘟病毒感染猪血管内皮细胞致细胞病变后的细胞形态变化和细胞器的变化,探讨猪瘟病毒致猪血管内皮细胞病变的机理。 猪瘟病毒E2基因编码的gp55 蛋白是猪瘟病毒的主要保护性抗原,是目前研制猪瘟基因工程疫苗的首选基因。采用来源于猪的PK–15 细胞做为受体细胞,利用哺乳动物细胞表达载体表达E2基因,一方面可充分利用受体细胞遗传密码子的嗜好性,提高重组蛋白的表达量,另一方面因为PK–15 细胞来源于猪,后加工与其他表达宿主相比具有无比的优越性,其免疫原性和疫苗的免疫保护力可望得到很大提高,为猪瘟病毒基因工程疫苗投入实际应用奠定基础。 本研究由三部分构成,第一部分是建立猪脐静脉血管内皮细胞的培养方法,利用猪瘟病毒Shimen株感染猪脐静脉血管内皮细胞,研究猪瘟Shimen 株致细胞病变效应后的形态变化和细胞器的变化,初步探讨了猪瘟病毒致猪血管内皮细胞病变的分子基础。第二部分利用DDRT–PCR技术分析了猪瘟Shimen 株致猪脐静脉血管内皮细胞病变前后表达差异的基因,共发现了推测为猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变的11条敏感基因。第三部分是利用PK–15 细胞作为受体细胞,表达猪瘟病毒E2基因,为建立以重组蛋白为抗原的猪瘟病毒检测方法和猪瘟基因工程疫苗的应用奠定基础。主要试验和结果如下: 1.选用I 型胶原酶,采用Jaffe 式灌流法成功的分离和培养了猪脐静脉血管内皮细胞。扫描电镜观察和第Ⅷ因子相关抗原(F-ⅧR Ag)检测阳性,证明分离培养的细胞为血


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