仔猪胰腺干细胞的分离鉴定

【摘要】：近年来糖尿病的患病率日益增高,已成为继心血管疾病、肿瘤之后第三大高发慢性病。快速、有效、长期地补充机体胰岛素分泌不足是糖尿病治疗的根本方案。目前采用三种方法补充机体胰岛素分泌不足:传统皮下注射外源性胰岛素,虽然有效但很难阻止并发症的发生和发展,注射剂量经常与机体需要不相符,且每日每餐均需注射很繁琐;胰腺和胰岛器官移植,可解决胰岛素供需不符的问题,但移植器官难得、手术复杂、不良反应多;移植分泌胰岛素的干细胞,可以弥补上述两种方法不足,简易地注入人体成为自身胰腺细胞,一次给药长期有效,机体还可根据需要,调节产生胰岛素和其他辅助细胞因子等的多种细胞比例,避免并发症发生,干细胞增殖力强、数量充足、移植排斥反应低。但也是由于供体组织严重匮乏限制其应用发展,人们转向寻找异种动物胰腺组织作为供体组织来源时发现,猪繁殖性能强,组织来源充足,胰岛素结构和生物活性类似于人胰岛素,血糖调定点同人接近,猪胰腺细胞可在人血清中生存对人体无害,因此,仔猪胰腺干细胞可作为最佳的异种动物胰腺干细胞的供体细胞,对仔猪胰腺干细胞的研究是糖尿病治疗的新希望。本试验从仔猪胰腺干细胞分离培养、生物学性能测定及诱导分化多能性三个方面进行研究,为仔猪胰腺干细胞的临床应用提供基础资料。 1. 建立仔猪胰腺干细胞的分离方法和培养体系。 取新鲜的仔猪胰腺组织,冰上操作,0.25%胰酶消化,形成小细胞团和单个细胞,过滤,低速、多次离心,或以5%BSA作离心液离心,均可获得高活力的胰腺细胞,用层粘连蛋白或明胶铺被培养皿,以低糖DMEM 培养液添加10%血清及10 mmol/L 烟碱作为基础培养液,培养2d 后,除去未贴壁细胞,更换为去除烟碱、添加10 ng/mL EGF的基础培养液,长期培养以促进胰腺干细胞体外增殖生长。证实仔猪胰腺内分泌祖细胞呈多突起细胞形态。 2. 仔猪胰腺干细胞各项生物学特性。 原代细胞以细胞团和单个细胞贴壁,细胞团中不断有细胞脱离、悬浮,保留的贴壁细胞和单个细胞生长,约7d 出现多突起内分泌祖细胞,克隆样生长,很快连接成网状;小圆细胞数量增多;多角形导管上皮干细胞增殖慢。电镜观察多突起细胞具50~80μm长突起、有极性、核质比大、细胞器不发达;小圆细胞为直径10~12μm、有微绒毛、胰岛素阳性;多角形细胞呈圆形、核质比大、可见胞质内细胞器和细小分泌颗粒。成功地分离到三种形态的胰岛干细胞:多角形胰导管细胞、多突起内分泌祖细胞和小圆细胞。免疫组化鉴定,分离的细胞表达胚胎干细胞标志SSEA-1、SSEA-4、Oct4,也表达胰腺干细胞的标志PDX-1、CK7 等,证实分离的细胞具有胰腺干细胞特征。 测定仔猪胰腺干细胞的生长曲线。分离培养的胰腺干细胞体外生长12~15d 可传代,