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草鱼MyoD基因cDNA克隆和表达研究

王立新  
【摘要】:MyoD基因是生肌调节因子MRFs家族的主要成员之一,是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主导调控基因之一,对骨骼肌的形成和分化起主要作用,MyoD缺失可导致成肌细胞的增殖和分化无法进行。而MSTN(myostatin,肌肉生长抑制素)基因属于TGF-β(transforming growth factor beta,转化生长因子)超家族,其功能是抑制成肌细胞的过度增殖,是肌肉发育的负调控基因。现代肌肉发育生物学的研究表明,影响脊椎动物肌肉生长和肌肉品质的肌纤维的数量在出生前就已决定,出生后肌肉的生长主要靠肌纤维长度和周径的增大,而肌纤维的增粗又会影响肌肉的嫩度和肉用品质。同时获得高的肌肉生长(净肉率)和优良的肉质品质是肉用动物生产一直追求但却无法实现的理想目标。MyoD及其相关基因的发现为解决这一难题提供了可能,但对于该基因的研究目前还主要集中在基因的结构功能、组织表达、多态性以及肌肉瘤的医学诊断上,而在肉用动物生产中的研究还未受到重视。本研究以我国池塘主要养殖品种草鱼为研究对象,旨在通过对草鱼MyoD基因克隆、重组表达以及在不同发育阶段表达规律的研究,为鱼类肌肉品质改良提供理论依据,也为鱼类高效养殖探索新的途径,该项研究对于我国这样一个水产养殖大国来说无疑具有很高的社会和经济价值。 为此本研究用RT—PCR和RACE技术从受精后22h(水温约为24℃)的草鱼肌节期胚胎总RNA中扩增获得了草鱼MyoD全长cDNA序列,并对核苷酸和氨基酸序列进行了分析,构建了草鱼MyoD基因的原核和真核表达载体,获得了相应的重组基因工程菌,并对基因工程菌进行了诱导表达研究;与此同时,本研究还对MyoD基因在草鱼不同发育阶段的表达规律及其与负调控基因MSTN之间的表达关系进行了初步研究,得到如下结果: 1.首次克隆并获得了草鱼MyoD全长cDNA序列。 草鱼MyoD cDNA序列全长为1597bp,其中编码蛋白的开放阅读框位于186~1011bp,长825bp,共编码275个氨基酸;编码的蛋白的分子量为30.87kD。蛋白质结构分析表明草鱼MyoD基因具有该家族基因典型的碱性螺旋环螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)结构域,其中编码肽链的第1-84个氨基酸为草鱼MyoD基因的Basic区,第98~142个氨基酸为草鱼MyoD基因的HLH结构域;SignalP 3.0和Tmpred(prediction oftransmembrane regions and orientation)在线结构分析也发现,该肽链没有信号肽和跨膜区段,这和该基因只在胚胎期骨骼肌细胞中表达的组织特异性相符。 2.分析并揭示了MyoD基因结构和脊椎动物进化的关系 通过对不同分类地位脊椎动物MyoD基因的核苷酸序列和氨基酸序列深入分析发现:①MyoD基因的保守性较高,且氨基酸肽链的长度随动物由低等到高等有逐渐加长


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