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甘蓝型油菜再生体系与农杆菌介导的甜菜碱合成基因遗传转化研究

韩德俊  
【摘要】:十字花科(Cruifrae)芸薹属(Brassica genus)包含了一些重要的油料作物和蔬菜作物,其中有6个物种被广泛种植。甘蓝型油菜(Brassica.napus L.)是全球继大豆和棕榈油之后第三大油料作物。随着人类需求的增加和新科技手段的不断涌现,油菜品种改良正呈多元化发展,植物转基因技术在油菜遗传改良中广泛应用,推动了油菜遗传育种工程技术进行一次新的革命。转基因技术已经成为向油菜导入新型外源基因的重要手段,转基因抗除草剂油菜、抗虫油菜、高油脂含量油菜、油菜新型不育系等已大规模投入商业化生产,抗病、抗环境逆境胁迫(干旱、盐碱、高温和低温)等新型油菜育种材料的创制已成为重要研究课题。 本研究主要目标是,立足西北地区油菜品种,筛选最佳转化受体,建立农杆菌介导的油菜高效转化体系,获得CMO和BADH抗盐耐旱基因的油菜转化体,为利用基因工程改良油菜奠定基础。 研究了甘蓝型油菜花茎外植体高效诱导不定芽的再生体系,结果表明:以含有2,4-D(0.5~1.0mg/L)的培养基对外植体进行预培养,以及在分化培养基中加入AgNO_3(2~6mg/L),可显著降低外植体褐化坏死的频率,提高了不定芽的发生频率及其再生能力;6BA(2.5mg/L)与NAA(0.1mg/L)配合使用有利于提高不定芽发生频率;再生的不定芽90%可长根。 研究了油菜未成熟胚胎离体培养条件下的几种再生方式。结果表明,油菜幼胚离体培养以三种方式实现再生:①幼胚早熟萌发,在茎顶端分生组织区依次产生多个额外子叶,表明幼胚外植体仍保持着胚性发育特点;②子叶近轴端和下胚轴表面直接产生类胚结构,继代后部分类胚结构可发育成体细胞胚,其它则由于无茎顶端分生组织,最终不能形成完整植株;③外植体细胞脱分化形成愈伤组织,继代后胚性愈伤组织产生单生的体细胞胚,最终可发育成完整的小植株。2,4—D是影响外植体再生方式的重要因素,它抑制了幼胚早熟萌发。在无2,4—D的培养基上,幼胚早熟萌发,主要以第一种方式实现再生;在2,4—D诱导下,外植体主要以第二或第三种方式再生。不同基因型间在外植体再生方式和体胚诱导率上存在差异。 以30个甘蓝型油菜品种(系)的子叶和下胚轴为外植体,研究了子叶和下胚轴的再生能力和再生方式,以及在抗菌素(羧苄青霉素和头孢霉素)和筛选剂(卡那霉素)胁迫下,各基因型子叶和下胚轴外植体的再生能力。结果表明,油菜子叶和下胚轴外植体主


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