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梨离体再生和遗传转化的研究

徐凌飞  
【摘要】:本研究以砀山酥梨(P.bretschnrideri Rehd.)、八月红梨(P.communis L.X P.bretschnrideri Rehd.)等多个栽培品种为试验材料,通过对影响叶片、叶柄和节间茎段离体再生不定芽以及根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化的若干因素的研究,建立起不同外植体水平的梨再生体系以及遗传转化体系。利用几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶双价基因进行了遗传转化,分子生物学分析证明,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶双价基因已经整合到转化植株基因组中,获得了八月红梨和砀山酥梨2个品种的转基因植株。 主要研究结果如下: 1.试验从砀山酥、八月红等5个梨品种叶片诱导出不定芽,其中砀山酥、八月红、早酥梨等品种叶片再生不定芽为首次获得,建立起八月红、水晶和砀山酥梨等品种叶片高效再生体系。 试验系统地研究了影响梨叶片再生不定芽的多种因子的效应,建立起叶片高效再生体系。在最佳条件下,八月红、水晶和砀山酥梨的再生频率分别100%、77.8%和83.3%,平均再生芽数分别为5.78、3.17和1.58。 不同品种叶片再生效率不同,基因型是影响叶片再生能力的关键因子,八月红梨叶片再生能力高于其它品种。基本培养基类型对叶片再生有重要影响,NN69培养基适宜于梨叶片再生。采用试管苗顶部幼嫩叶片为外植体,叶片接种时叶片远轴面向下接触培养基,培养基附加40g·L~(-1)蔗糖,培养基pH值为5.6,接种后暗培养20d等可显著地提高叶片再生频率。植物激素种类组成和浓度配比是影响梨叶片离体再生的最关键因子之一,不同梨品种叶片高频率再生需要不同的激素种类组合和浓度配比。TDZ适宜八月红和水晶梨叶片再生,6-BA适宜砀山酥梨和红茄梨叶片再生,ZT和KT不适宜梨叶片再生。生长素种类对梨叶片再生不定芽有显著影响。IBA适宜于八月红梨叶片再生,IAA适宜于水晶梨叶片再生。培养基附加0.5mg·L~(-1) AgNO_3 可显著地提高八月红梨叶片再生频率。 基木培养基类型和6-BA浓度是影响砀山酥梨叶片再生芽增殖的主要因素,适宜的增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L~(-1)+IBA 0.2 mg·L~(-1)。 利用正交试验设计研究了基本培养基、吲哚丁酸、茶乙酸、蔗糖、暗培养时间等5个因素对砀山酥、八月红梨叶片再生苗生根的影响。结果表明,砀同酥梨叶片再生苗生根的适宜组合为1/4MS+0.5 mg·L~(-1) IBA+ sucrose 20 g·L~(-1),暗培养5d。八月红梨叶片再生苗生根的适宜组合为1/4MS+0.3 mg·L~(-1) IBA+ sucrose 30 g·L~(-1),暗培养7d。 2.梨叶柄再生困难,试验首次从八月红和水晶梨叶柄诱导出不定芽。 植物激素对梨叶柄再生有重要影响。细胞分裂素TDZ适宜于叶柄再生,ZT对叶柄再生没有作用,TDZ与生长素IBA、IAA和NAA的不同组合,可明显影响叶柄再生效率。培养基附加AgNO_3


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