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水疱性口炎病毒糖蛋白截短后在大肠杆菌中的表达和诊断技术的研究

祁会彩  
【摘要】: 水疱性口炎(Vesicular Stomatitis,VS)被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病,在我国进出境动物检疫对象中被列为二类病,尽管目前我国还没有该病流行的报道,但随着我国加入WTO,动物及动物产品的国际贸易增加,为防止国外疫情流入我国,保护我国畜牧业的健康发展,有必要对该病进行研究。 VS由弹状病毒科水疱病毒属的水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)引起的牛、马、猪等多种哺乳动物的一种急性、高度接触性传染病。VSV由5种不同的主要蛋白构成,分别为核(N)蛋白、磷酸(P)蛋白、基质(M)蛋白、糖(G)蛋白及RNA聚合酶(L)蛋白,其中核蛋白和糖蛋白在病毒免疫和诊断具有重要的意义;N蛋白是病毒衣壳蛋白,由N基因编码,呈群特异性,刺激机体产生非中和抗体;G蛋白由G基因编码,是病毒的主要抗原,决定着病毒的毒力,也是病毒的保护性抗原,它能刺激机体产生中和抗体,呈现型、亚型、乃至株的特异性。 根据文献报道,利用PCR技术扩增编码水疱性口炎病毒IND型(VSV-IND)糖蛋白(G)基因不含信号肽、胞内区和跨膜区的主要抗原表位区,通过引入其两端的EcoR I和Xho I酶切位点定向插入到pET-30c质粒T7启动子下游的多克隆区,构建重组质粒pET-30c-vsvG并转化至宿主菌BL21(DE3)株中。用1 mmol/L IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳表明重组蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达,经过4 h表达量即可达到高峰,重组蛋白的相对分子质量为57 ku;Western-blot检测证明,所表达的重组蛋白能被VSV-IND阳性血清所识别。 重组蛋白含有六聚组氨酸尾,主要以包涵体形式存在,经镍柱纯化后作为包被抗原建立了间接ELISA,试验证明其具有较高的抗原活性,且具有良好的型特异性,纯化后的重组蛋白有望在LP-ELISA中取代全病毒成为标准的诊断抗原和用于基因工程疫苗的研制。 本研究还针对FMDV的3D基因、SVDV的VP1基因与VSV的N基因设计了三对引物,建立了多重RT-PCR,可以一次性检测出VSV、FMDV和SVDV的单独或混合感染。应用该方法可以比较简单且经济的鉴别猪的三种水泡性疾病,由于其特异、敏感、快速、简便,故有广阔的应用前景。


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