猪瘟病毒E2基因在PK-15细胞中的表达及本体动物的免疫研究

【摘要】： 猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪的急性高度接触性传染病,是严重威胁养猪业,具有重要经济意义的病毒性疾病之一。猪瘟病毒可引起猪小血管和毛细血管内皮细胞发生变性、坏死,表现为全身组织器官弥漫性出血。猪瘟病毒为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员,基因组大小约12.3kb,含一个大的开放阅读框(ORF),由11个编码结构蛋白与非结构蛋白的基因组成。 猪瘟病毒E2基因编码的gp55蛋白是猪瘟病毒的主要保护性抗原,是研制猪瘟基因工程疫苗的首选基因。采用来源于猪的PK–15细胞做为表达系统,一方面可利用猪细胞对猪瘟病毒遗传密码子的嗜好性,提高E2蛋白的表达量,另一方面猪源细胞表达的E2蛋白的加工与其他表达系统相比有无比的优越性,其免疫原性和疫苗的免疫保护力可望得到很大提高,为猪瘟病毒基因工程疫苗投入实际应用奠定基础。 本研究由三部分构成,第一部分是采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR)克隆出猪瘟病毒石门株的E2基因,并对其核苷酸序列及氨基酸序列的同源性进行比较及分析,绘制系统关系发生树,以期了解猪瘟病毒石门株经多次传代后E2基因的遗传变异情况,为用其研制猪瘟基因工程疫苗提供毒株分子生物学方面的资料。第二部分是用逆转录病毒载体将猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因整合到PK-15细胞基因组中,在PK-15细胞的细胞膜上表达猪瘟病毒E2基因囊膜蛋白。第三部分用表达囊膜蛋白的PK-15细胞免疫Balb/c小鼠和猪,检测抗体水平,并对免疫接种猪进行攻毒试验,为猪瘟基因工程疫苗的应用奠定基础。 1.采用RT-PCR和nPCR扩增出猪瘟病毒石门株E2基因,将其分别克隆于pGEM-T Easy载体并进行核苷酸序列测定,进行了核苷酸及氨基酸序列同源性比较,绘制了系统关系树。结果表明,所测CSFV石门株E2基因的长度为1170 bp,编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和部分跨膜序列,共由384个氨基酸组成。将石门株与C株疫苗毒E2基因的核苷酸和所推导的氨基酸序列进行比较,表明其核苷酸序列同源性为94.5%,所推导的氨基酸序列同源性为93. 8%,说明石门株与C株疫苗毒之间存在一定的差异。 2.将猪瘟病毒石门株E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染,将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析和免疫荧光染色鉴定,结果表明猪瘟病毒E2基因在PK-15细胞膜上成功表达。 3.将表达E2蛋白的PK-15细胞作为基因工程细胞苗腹腔免疫Balb/c小鼠,经FACS