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中国原产华东葡萄抗白粉病基因cDNA文库构建及其EST序列分析

徐炎  
【摘要】:葡萄白粉病[Uncinula necator(Schw.)Burr.]是影响世界葡萄生产的主要病害之一。育种实践证明,培育抗病品种是控制葡萄白粉病的经济有效途径。原产我国葡萄野生种华东葡萄(Vitis pseudoreticulata W.T.Wang)株系“白河-35-1”,在多年研究证明它对我国葡萄白粉病表现出极强的抗病性;对其抗白粉病相关基因进行克隆研究不仅有利于阐明抗病机制,而且对葡萄抗白粉病研究及抗病基因的育种利用具有重要价值。本研究以cDNA文库为基础,以测序为主线,结合生物信息学方法和PCR技术对获得的目标序列进行结构和表达分析,以期获得与抗病有关的EST序列和抗病相关基因。取得如下主要结果: 1.以中国原产华东葡萄株系“白河-35-1”为材料,于2003年7月8日上午8:00-10:00,在西北农林科技大学葡萄种质资源圃进行接种实验;在接种前,选取健康的华东葡萄株系“白河-35-1”的幼叶,用无菌蒸馏水喷湿接种叶片的上叶面,从高度感病的中国原产华东葡萄株系“湖南-1”上取感白粉病的叶片,用病叶压片法人工接种葡萄白粉病病原菌,接种后立即套袋。在接种后1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d剪去1.0cm~2大小的幼叶叶片,立即放置液氮中,用SDS/酚法提取总RNA;用不同接种时间白粉病病原菌[U.necator(Schw.)Burr.]诱导的叶片分别提取总RNA,然后混合提取的RNA样形成总RNA构建华东葡萄叶片cDNA文库。文库初始滴度为3.0×10~5pfu/ml,重组率为96.9%,用包装后的原始文库直接转化寄主菌BM 25.8,转化效率为90%以上,插入片段主要分布在0.5-3.O kb之间,平均大小为900bp左右。 2.通过随机测序,获得了107条质量好的cDNA序列;并已登录GenBank数据库,登录号分别为:AY848693、DQ336280、DQ 336281、DQ 336282、DQ 336283、DQ 336284、DQ336285、DQ336286、DQ336287、DQ336288、DQ336289、DQ339462、DQ 339463、DQ 339464、DQ354157、DQ354158、DQ354159、DQ354160、DQ354161、DT646287、DT661587、DT 661588、DT661589、DT661590、DT661591、DT661592、DT661594、DT 661595、DT 661596、DT 661597、DT661598、DT661599、DT6615600、DT661601、DT661603、DT661605、DT661608、DT661610、DT 661611、DT661613、DT661614、DT661615、DT661616、DT661618、DT661619、DV182076、DV182077、DV182078、DV182080、DV182981、DV182082、DV182084、DV182085、DV182086、DV182087、DV182088、DV182089、DV182090、DV182091、DV182092、DV182093、DV182094、


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