小麦条锈菌cDNA文库构建和表达序列标签（ESTs）分析

【摘要】： 条形柄锈菌小麦专化型Puccinia striiformis f.sp tritici引起的小麦条锈病是我国小麦生产最重要的病害之一,抗病品种的选育和合理使用是防治病害的最为有效地措施。然而由于病原菌毒性变异问题十分突出,新选育的抗病品种很快丧失抗病性,严重威胁着小麦的可持续生产。一个多世纪以来,许多研究人员从流行学、细胞学和群体生物学对禾谷类锈菌进行了深入细致的研究。但是由于锈菌是专性寄生菌,无法获得纯培养,难以建立其分子遗传操作体系,更由于小麦条锈菌缺乏有性阶段的特点,至今对其遗传变异和致病机理的认识十分有限。近年来随着分子生物学和基因组学的迅猛发展,推动了诸如条锈菌等以前难以深入研究的病原菌及其与寄主互作过程中功能基因的分析和鉴定。 夏孢子萌发是锈菌发育与寄主早期互作的关键阶段,这一时期锈菌体内发生的基因表达调控和代谢活动的状况,和锈菌成功侵染小麦建立寄生关系密切相关。分析和鉴定小麦条锈菌在其夏孢子萌发这一重要发育过程中的基因表达情况,对于从分子水平认识条锈菌的阶段发育、揭示条锈菌的致病分子机理无疑具有重要价值。本研究采用SMART技术构建了小麦条锈菌夏孢子萌发特异性的cDNA文库,通过大规模EST测序、基因注释和功能分类,结合半定量RT-PCR和生物信息学方法,研究了小麦条锈菌夏孢子萌发特定时期的基因表达特征,通过研究取得了以下主要结果: 1.探索并优化了小麦条锈菌Puccinia striiformis f.sp tritici 32号生理小种(CY32)大规模夏孢子萌发的适宜条件。CY32夏孢子萌发的最适温度为9℃,最适宜的孢子量是6mg/200mL水,适宜的溶液是无菌蒸馏水。 2.采用SMART技术构建了小麦条锈菌CY32夏孢子萌发阶段的非均一化cDNA文库。文库的滴度为1.1×106 pfu/mL,重组率为87.5 %,文库所含独立克隆数为5.775×105个,插入片段平均长度为750bp ,文库质量符合标准要求。 3.对6000个随机挑选的克隆从5’端测序,获得4798条有效EST序列,测序成功率80%。4798条有效EST序列经过质量控制和拼接后得到315个contigs和803个singletons,共1118个一致序列,451个一致序列可以在数据库中找到最佳匹配序列,其中具明确功能的有264个,187个与己知序列同源但功能未知,其余的667个没有注释信息。可以找到最佳匹配序列的表达基因在蛋白水平上大约有40.47%与丝状真菌蛋白具有同源性,39.07%与酵母具有同源性。功能已知基因按其功能分为细胞分裂与染色体结构、细胞信号与交流、细胞结构与生长、代谢、细胞防御、蛋白合成、RNA合成、转座八大类,功能未知或没有匹配序列的将其归为未分类。参与细胞信号与交流等功能