壳寡糖对烟草花叶病毒的诱导抗病作用和体外抑制作用

【摘要】： 壳寡糖是氨基葡萄糖通过β-1,4键成苷而形成的2~10个单元的低聚糖。已有的研究表明壳寡糖具有多种生物活性,包括调解植物生理功能,激活动物免疫系统等。已有的研究表明,壳寡糖能够抑制植物病原真菌和细菌的生长,诱导植物产生对病原真菌和细菌的系统诱导抗病性。但缺少对植物病毒诱导抗病性和体外钝化作用的系统研究。本研究以海洋生物甲壳质制备的壳寡糖为材料,采用生物学、生物化学、分子生物学以及细胞学方法,系统研究了壳寡糖激发的烟草(Nicotiana tabacum)对烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus, TMV )的诱导抗病性,以及壳寡糖对TMV的体外钝化作用。本研究取得了以下主要结果: 1.证明了壳寡糖可以诱导烟草对TMV的侵染产生系统诱导抗病性,减轻了病毒侵染引起的系统症状,显症期推迟3～7 d,侵染点显著减少,平均发病严重度降低了80%以上,叶绿素含量保持在8.67μg/g,比不诱导对照提高了34.8%。激发抗病性表达的壳寡糖最佳浓度为50μg/mL,高于或低于该浓度均降低诱导效果。诱导处理后24h即可表现出抗病效应,持效期达9d以上。表达诱导抗病性的烟草植株兼抗黄瓜花叶病毒(CMV)。 2.研究表明壳寡糖诱导的防卫反应抑制了病毒增殖和长距离移动。在试验范围内,寡糖的分子质量和聚合度对其抑制效果无明显影响。 ELISA-DSM法测定表明,接种病毒7d后,诱导植株接种叶片的病毒浓度(OD值)是不诱导的38.1%,新生叶片则未检出病毒;利用心叶烟(Nicotiana glutinosa)进行的半叶枯斑法测定,也验证了该结果。应用实时荧光定量RT-PCR方法,对壳寡糖的诱导效应作了更精密的检测,发现诱导处理的烟草体内TMV-CP基因的蓄积量显著减少,在接种病毒7d后,诱导植株叶片内CP的蓄积量仅为同期不诱导对照的25.8%。这表明壳寡糖诱导使病毒复制减少。 ELISA-DSM法测定,半叶枯斑法测定,以及电镜观察都表明,壳寡糖诱导处理显著抑制了病毒粒体在烟草体内的上行与下行长距离移动。病毒粒体移动时间延迟,移动数量大幅度减少。 3.壳寡糖诱导处理后,烟草体内出现了氧化迸发,活性氧水平增高,防御酶系发生了明显变化,发病相关蛋白质PR1-a强烈表达。 壳寡糖(50μg/mL)喷雾处理普通烟幼苗,24h后接种病毒,烟草体内过氧化氢(H2O2)含量高于对照。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性在接种后有大幅度升高,先后出