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转Ac/Ds转座因子大豆后代的鉴定与分析

刘斌  
【摘要】: 突变体是分析基因功能最有效的材料,通过比较突变体与野生型在特定环境条件下基因表达的差异可以获取基因功能的重要信息。构建大豆突变体库,集中各种变异性状可以为大豆基因的功能分析提供材料。转座子标签法可以用于突变体库的构建及功能基因的克隆,是功能基因组学研究的重要手段。目前,T-DNA标签与转座子标签相结合,已成功地构建了拟南芥等植物的突变体库,在水稻功能基因组研究中也取得了一定的进展。然而,在大豆中这方面的研究仍然较少。 本研究试图利用分子生物学手段,对本实验室前期转化获得的Ac和Ds T0代940株再生植株及其T1、T2后代3000余株进行检测,从而筛选得到纯合系。在研究过程中鉴定出一个表型突变体,并对这一表型突变体进行了初步分析,为大豆突变群体的构建、突变基因的克隆和大豆功能基因组学研究奠定了基础。具体研究结果如下: 1、对前期获得的Ac340株、Ds 600株T0代大豆转化再生植株进行了叶片巴龙霉素抗性离体检测,初步确定了转基因植株。 2、对转化获得的T0代植株及其T1、T2后代进行了nptⅡ标记基因、目的基因的PCR以及Southern dot blot检测和测序分析,初步得到了Ac纯合系7个,Ds纯合系9个,并利用RT-PCR检测到了目的基因的转录。 3、摸索了利用卡那霉素叶片涂抹法进行大豆转基因植株快速筛选的可靠性。确定其最佳筛选浓度为500mg/L,筛选临界观察时间以3天为宜,并在此基础上,对转基因植株(含nptⅡ基因)分离后代进行了卡那霉素涂抹检测和PCR检测,验证了2种检测方法的符合度。结果表明:抗和高抗卡那霉素植株的PCR检测符合度为90.8%,感和高感卡那霉素植株的PCR检测符合度为87.1%。 4、获得了突变株系Ac31-1,其T0代与转化受体同样表现为白花和黄色种皮,但T1代种皮颜色由黄色变为绿色,花色依然为白色;在14株T2代植株中,有9株花色由白色变为紫色,T2代种子的种皮颜色也出现分离,绿色、黄色以及介于绿色和黄色之间的颜色都有出现。 5、通过测序验证和SSR检测,确定了Ac31-1突变系的纯度,保证了其来源的可靠性,为后续研究奠定了基础。


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