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铁还原微生物的分离鉴定及系统发育学分析

关舒元  
【摘要】: 细菌的异化Fe(III)还原是生物进化过程中最早出现的生物能量代谢途径,多种古细菌和真细菌具有还原Fe(III)的能力。厌氧条件下环境中的Fe(III)氧化物发生还原,并且这一过程主要是微生物介导的异化还原,即微生物以Fe(III)氧化物为最终电子受体的厌氧呼吸过程。在自然界中只要存在厌氧环境,几乎都会发生异化Fe(III)还原现象,并发现有异化铁还原微生物存在。异化Fe(III)还原被认为是地球上最早的呼吸形式之一,在生命的进化历程中这一遗传烙印在一定范围和一定程度上都会被继承,且势必有更多的微生物种类都具有还原Fe(III)的能力或潜能。因此,加强异化Fe(III)还原研究对于揭示地球早期生命的能量代谢特征和生命进化具有重要的理论意义。水稻土作为一种研究氧化还原过程的模式系统一直受到人们的重视,其中铁的氧化还原占有重要地位。因而系统开展Fe(III)还原微生物特性的研究,对于阐明土壤中氧化铁的微生物还原机理、认识异化铁还原在稻田生态系统中的重要作用,促进水稻土中污染物的转化与修复具有重要的理论和实际意义。 本文通过对采自四川和江西两地的典型水稻土样品的厌氧富集培养试验,初步确立了从水稻土中分离纯化铁还原微生物的方法。进一步对分离纯化得到的一些菌株进行菌体菌落形态特征和生理特征鉴定和铁还原菌利用不同碳源时的Fe(III)还原特征比较,通过对铁还原菌株的16S rDNA序列分析,以便确定其在系统发育分类中的地位。试验得出以下主要结论: (1)采用富集培养方法,从四川水稻土中分离得到四株铁还原菌P4、8_(13)、8_(18)和8_(19),从江西水稻土中分离得到三株铁还原菌4_(03)、4_(10)和4_(20)。这7个菌株在菌体菌落形态和生理特征上表现出一定的共性。其菌落特征为:菌落较小,白色,隆起,规则圆,不透明,表面光滑,直径3mm左右。染色结果表明,这7株菌为革兰氏阳性,杆状,圆末端。通过生长曲线测定,这7株菌在培养的10~25 h之间达到对数生长期。由此可知,在30℃培养条件下用50% LB液体培养基扩繁1d即可达到菌株的快速生长的要求。 (2)通过将三代铁还原菌接种于氢氧化铁液体培养基中,以三代菌体的Fe(III)的还原率对这7个菌株的铁还原稳定性进行考察,7个菌株的Fe(III)的还原率均在70% ~ 90%之间,说明这7株菌体的铁还原能力比较稳定。 (3)为了能更加准确地反映不同菌株在利用不同碳源时对Fe(OH)_3还原的影响,通过比较菌株P4在利用9.6 mmol/L和60 mmol/L 2种浓度碳源时对Fe(OH)_3还原的影响及其铁还原特征分析得出,选用60 mmol/L碳源浓度能较好的对不同铁还原微生物进行铁还原功能强弱的初步划分。 (4)不同碳源利用试验表明,葡萄糖和丙酮酸钠可作为这7个菌株的优势碳源。这7个菌株在利用葡萄糖时的Fe(III)还原量最大,反应速率(Vmax)最高。不同菌株利用葡萄糖的Fe(III)还原最大潜势大小顺序为:菌株8_(18)4_(20)4_(03)8_(13)P44_(10)8_(19)。由计算出的铁还原率比较可知,菌株818的Fe(III)还原率最高,高达92.11%,最低的菌株819只有24.52%。整个体系在添加葡萄糖、丙酮酸钠培养初期的pH迅速下降至最低点4.5~5.5之间,随后缓慢回升至6.5左右。而添加其他碳源时铁还原进行的缓慢,pH始终维持在7.0~7.5左右。可见在微生物正常生长的pH范围内,较低的pH利于Fe(III)的还原。 (5)采用PCR技术获得了1325 bp的铁还原菌株P4的部分16S rDNA序列。经NCBI的MegaBlast同源性分析和利用Clustal和Phylip软件构建铁还原菌株P4与相关菌株16S rDNA的系统进化树,可以看出铁还原菌株P4与多种不可培养的厌氧菌株(DQ441334,DQ083720,DQ083732,AM176850,AY953222)均达到98%同源性,并且和多种丁酸梭状芽孢杆菌株(AY604563,AM176850,DQ831126,X77834,AF005092)也有98%的同源性。因此可将菌株P4归属为厌氧丁酸梭状芽胞杆菌。


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