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辣椒疫病抗性相关基因的克隆与分析

马维  
【摘要】: 辣椒疫病是一种毁灭性的病害,在世界各地的辣椒种植区普遍发生,现已成为影响我国辣椒生产的主要障碍。由于辣椒疫病的病原菌能在土壤中长期存活,并且适宜于辣椒生长的温湿度也非常适合于疫霉菌的生长和繁殖,因此辣椒疫病常暴发流行。选育抗病品种是防止或减轻辣椒疫病危害的有效途径。多数学者认为辣椒对疫病没有免疫品种,对疫病的抗性遗传规律也相当复杂。因此,抗疫病相关基因的克隆、标记及定位,是辣椒分子标记辅助选育抗病品种的关键步骤。 本研究以西北农林科技大学园艺学院辣椒课题组的辣椒抗疫病品种A1、A2、A5和A15及感疫病品种B2和2096为材料,用改良SDS法提取辣椒叶片DNA,根据GenBank中登录的抗病基因的保守结构域设计简并引物,对这些辣椒材料进行PCR扩增,得到了一批抗病基因同源序列(RGAs),并对其进行了分析。获得了以下主要结果: 1.根据烟草抗TMV的N基因(U15605)、亚麻抗锈病的L6基因(U27081)和拟南芥抗番茄丁香假单胞细菌的RPS2基因(U12860)的NBS类型保守结构域的两个亚结构域P-loop和Kinase-2a设计一对简并引物YB5和YB8,从6个不同抗、感疫病的辣椒材料中扩增得到17个RGAs,将所有序列提交至GenBank,获得基因登录号:EF194114 -EF194130。对其中可通读的14个序列进行BLAST分析,发现它们与番茄、辣椒、马铃薯、烟草的抗病基因或抗病基因同源序列有较高的相似性(81%-97%)。对14个可通读的RGAs与已知抗病基因Gap2、I2C-1、Xa1、L6、RPP5、N、RPS2、Mi1.2和Bs2的NBS区域进行氨基酸多序列比对,发现它们都与已知的抗病基因的保守结构域相当一致,都包含NBS类抗病基因所特有的保守结构域P-loop (GVGKTT)和Kinase-2 ( LLVLDDVW )。 2.根据番茄抗叶霉病基因Cf-2(U42445)和Cf-9(U15936)基因C端的LRR类保守结构域设计一对简并引物YB17和YB18,从6个不同抗、感疫病的辣椒材料扩增得到27个RGAs。将所有序列提交至GenBank,获得基因登录号:EF064260-EF064286。其中,18个序列的最长ORF在130个AA以上,7个序列的最长ORF在80-130个AA之间,2个序列的最大ORF在80个AA以下。对序列进行BLAST分析发现,21个RGAs与番茄抗叶霉病基因有较高的相似性(80%-96%)。多序列比对发现A5-1、A5-5所推测的多肽序列与已知的抗病基因Cf2编码的多肽序列具有较高的相似性,特别是在某些结构域上完全一致。 3.根据马铃薯抗晚疫病基因RB (GenBank登录号:AY303171)序列,利用Primer软件设计一对特异引物YB25和YB26,从6个不同抗、感疫病的辣椒材料中扩增得到10个RGAs。BLAST分析发现,10个RGAs与马铃薯晚疫病抗性蛋白基因的相似性为87%-90%。将10个RGAs的核苷酸序列进行多序列比对发现它们之间的相似性为82% -100%。将10个RGAs推测的氨基酸序列与已知马铃薯抗晚疫病基因SH10、RPI、RGA1、RGA2、RGA3、RGA4、SH20和T118相应区域的氨基酸序列进行多序列比对,发现10个RGAs推测的氨基酸序列之间的相似性为71%-100%,与已知抗病基因相应区域氨基酸相似性为70%-90%;其中,A1-2、A5-1和B2-1与RGA4相应区域氨基酸相似性较高,分别为89%、89%和90%。 4.抗、感疫病的辣椒材料中都扩增得到了与辣椒抗疫病有关的RGAs。


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