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东北虎体细胞异种核移植

宋继梅  
【摘要】: 1.本研究用两种不同的组织块培养法进行了东北虎体细胞的原代培养,并比较了不同培养基、不同血清浓度及不同浓度的表皮生长因子(EGF)和胰岛素(insulin)对第7代东北虎皮肤成纤维细胞生长的影响,结果表明,用组织块培养法、冷消化过夜后组织块培养法,均能成功地进行东北虎皮肤成纤维细胞的原代培养;培养基DMEM/F-12及以DMEM/F-12为基础培养基添加20% (V/V)FBS更适于东北虎皮肤成纤维细胞的培养;以含10% FBS的DMEM/F-12为基础培养基添加1ng/mL EGF、10ng/mL EGF均能显著促进细胞生长,而添加5μg/mL、50μg/mL insulin对细胞生长无促进作用。 2.用组织块直接培养法和冷消化过夜处理后组织块培养法,均能成功地分离培养东北虎耳皮肤成纤维细胞。培养的细胞具有正常的成纤维细胞形态和正常的生长曲线及染色体数目;通过流式细胞仪检测细胞周期发现,随着汇合程度的增加,G0/G1期细胞所占的比例也升高。40%~50%与80%~90%、95%~100%汇合程度的细胞间G0/G1期和S期所占比例显著差异;80%~90%与95%~100%两汇合程度的细胞间G0/G1期和S期所占比例差异不显著。对相同汇合度(80%~90%)的细胞进行0.5%血清饥饿处理组与未处理组比较,饥饿处理组G0/G1期细胞比例略高,但差异不显著。95%~100%汇合组G0/G1期细胞比例稍高于饥饿组,但差异不显著。所以在核移植中,供体细胞不必进行常规血清饥饿处理,当细胞达到80%~90%以上汇合时,单就G0/G1期细胞比例而言,血清饥饿处理完全可以由接触抑制来代替。 3.在基础成熟液中,添加20%(V/V)发情当天、3天牛血清(OCSD0、OCSD3)能显著提高牛卵母细胞的成熟率;添加20%(V/V)发情第5天、7天牛血清(OCSD5、OCSD7)与对照组(添加20%FBS)相比无显著差异。添加30ng/mL EGF、50μg/mL insulin及50μg/mL insulin+30ng/mL EGF,与对照组相比,30ng/mL EGF组极显著地提高了牛卵母细胞成熟率,而添加50μg/mL insulin及50μg/mL insulin+30ng/mL EGF组牛卵母细胞成熟率稍低于对照组,但差异不显著。添加0.1μg/mL孕酮,成熟率显著降低;添加有溶血和无溶血的OCSD3,无溶血组显著提高牛卵母细胞成熟率,溶血组则显著降低。 4.用离子酶素联合6D激活牛卵母细胞,卵裂率和囊胚率分别为79%和20%以上,可以满足体细胞核移植的需要。用7%乙醇、7%乙醇联合6D及用离子酶素联合6D激活兔卵母细胞其卵裂率分别为75.6%、76.3%、77.8%;囊胚率分别为18.4%、14.3%、18.6%,差异均不显著,三种方法都可有效地激活兔卵母细胞。 5.本研究比较了在成熟液中添加发情当天的牛血清(OCSD0)、在胚胎培养液中添加EGF、insulin及孕酮、不同时期的发情牛血清对孤雌激活胚胎发育潜力的影响。结果显示,成熟培养液中添加OCSD0与FBS组相比,囊胚发育率无显著差异;培养液中添加EGF、insulin、孕酮与对照组相比,卵裂率和囊胚发育率均有显著提高。其中,添加孕酮组,卵裂率最高,为87.9%;添加insulin组,囊胚发育率最高,为61.3%。培养液中添加不同时期发情牛血清与对照组相比,卵裂率无显著差异,发情当天、3天、5天、7天牛血清组囊胚发育率显著高于对照组,7天组为最高,为65.8%。 6.分别以处于40%~50%汇合、80%~90%汇合、95%~100%汇合及经0.5%的血清饥饿3天处理的东北虎皮肤成纤维细胞(80%~90%汇合)为供体细胞时,四组的重组胚卵裂率、囊胚发育率均无显著差异, 95%~100%汇合组,卵裂率和囊胚发育率均稍高于其它各组。在比较注核与重组胚激活的不同时间间隔(0.5h、1h、2h、3h)对重构胚卵裂和囊胚发育的影响时,结果发现,重组胚激活前供体细胞在受体卵母细胞胞质内停留的时间越长,重组胚的卵裂率越高;而囊胚发育率则均无显著差异,但随着间隔时间的延长,囊胚发育率有增加的趋势。表明在核移植时,延长核质相互作用时间,可以提高重组胚的卵裂率和囊胚发育率。 7.用培养的东北虎皮肤成纤维细胞以每次1×106细胞/只的量腹腔注射免疫小鼠,每2周1次,共免疫2次。4周后尾静脉采血分离血清,测定效价为1:256。早期传代东北虎成纤维细胞及对照牛成纤维细胞以免疫血清为一抗,荧光标记兔抗鼠IgG为二抗,原位染色,荧光显微镜观察,结果显示免疫血清对东北虎皮肤成纤维细胞具有特异性,而牛成纤维细胞无特异性反应。东北虎成纤维细胞免疫小鼠血清作为一抗,荧光标记兔抗鼠IgG为二抗,进行荧光染色,检测不同时期重组克隆胚表面抗原,结果显示,桑葚胚之前着色不明显,桑葚胚以后着色明显,而对照成熟牛卵母细胞则染色不明显,说明供体东北虎体细胞表面抗原在重组胚细胞中表达,重组胚中遗传物质来自供体东北虎皮肤成纤维细胞。 8.采用生物软件DNASTAR分析牛东北虎线粒体基因组,利用PCR反应延伸过程中,3′端碱基不配对,PCR反应不能启动的PCR原理,以牛虎线粒体基因组中碱基差异较大的位点作为引物的3′端来设计引物,进行PCR扩增,从而分析牛-虎异种克隆胚中线粒体的变化情况。结果表明,重构胚发育到囊胚时期,来自东北虎的线粒体已经检测不到。


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