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端粒酶基因与大鼠胎儿神经干细胞永生化的研究

李勇  
【摘要】: 中枢神经系统的一些疾病(如帕金森氏病、Huntington病、脱髓鞘病和脑、脊髓损伤等)是因为神经细胞某一群体受损所致,它们严重的危害着人类健康,影响着人们的生活质量。传统的药物治疗只能缓解却不能根治这些疾病,并且神经系统对药物敏感,容易受到副作用的影响。近年来,随着细胞移植技术的发展和成熟,神经干细胞的移植已成为治疗这些疾病的有效途径。 神经干细胞是神经系统中特定的原始神经细胞,广泛的存在于哺乳动物中枢神经系统中的多个部位,它能通过分裂、增殖、分化能产生出所有神经组织细胞类型,在体内终生自我维持和更新。由于NSCs的自我更新能力、多分化潜能、低免疫源性和良好的迁移及组织融合性等特性,使之成为理想的基因或药物治疗载体和细胞移植供体。但是,神经干细胞在体外长期培养过程中出现复制衰老,并且神经干细胞增殖速度慢,传代周期长,使得它们的数量不能达到科研和临床的要求,阻碍了神经干细胞临床应用进程。而永生化神经干/祖细胞系在转基因治疗和中枢神经系统移植的研究中显示出诸多优点如在体外可以自我更新,大量扩增;通过基因操作使细胞稳定表达报告基因,进行体内示踪,或治疗基因;通过外源基因永生化的神经干细胞,在体内仍然能像正常神经干细胞一样具有多向分化潜能。 本研究构建重组质粒pEGFP-N1-hTERT并将其导入到大鼠胎儿神经干细胞中,对其荧光显微镜观察、CD133阳性细胞的流式细胞仪分析、培养特性测定、致瘤性试验、冻存等方面进行了较为系统的研究,主要得出以下结论: 1.大鼠胎儿神经干细胞培养体系的建立 通过对NSCs在无血清培养液SFCMⅠ和SFCMⅡ中生长情况,不同酶溶液消化传代对神经球形成的影响以及悬浮与贴壁培养方法对神经球增殖的差异进行分析,结果表明: (1)在试验中发现,无血清培养液SFCMⅠ是一种成熟的体外培养大鼠胎儿神经干细胞培养液,支持了神经干细胞在体外培养中的增殖和神经球的形成,能够达到神经干细胞增殖的需要。 (2)试验表明,在神经干细胞所形成的神经球传代时,AccutaseTM是一种较为理想的酶溶液,消化的后细胞的存活率在92.6%左右,在神经球消化时最好辅以轻轻吹打,保持神经球在悬浮状态下消化,这样不但减少了酶对细胞的作用时间,而且有效的防止了细胞间发生粘联,提高了活细胞比率和数量,在培养中也增加了形成神经球的数量。 (3)在细胞培养中发现,与明胶、鼠尾胶原和多聚赖氨酸包被处理的贴壁法培养细胞相比,1.5%的琼脂糖抗贴壁悬浮培养法更为适合神经干细胞的体外扩增。 2.大鼠胎儿神经干细胞冷冻保存和体外诱导分化试验 通过不同冷冻保护液对细胞冻存后的成活率和克隆形成率,以及3中细胞因子NGF、BDNF和GDNF对NSCs的诱导分化作用分析,认为: (1)可以根据实际情况使用D-MEM/F12+10%DMSO添加20%的FBS或NBS进行神经干细胞的低温冻存,超低温冻存对神经干细胞的多潜能性没有影响。 (2)实验结果表明,含有100 ng/mL的NGF、BDNF和GDNF培养液在体外培养时,对神经干细胞有一定的诱导作用。添加NGF和BDNF的诱导培养液中主要分化为神经元,而添加GDNF的诱导培养液中主要分行为少突胶质细胞。 3.pEGFP-N1-hTERT真核表达载体的构建与鉴定 通过双酶切鉴定、DNA测序分析证实人端粒酶逆转录酶基因片段的准确性,以及通过绿色荧光蛋白间接观察到人端粒酶逆转录酶在细胞中的表达定位,已验证所构建的真核表达质粒pEGFP- N1-hTERT的正确性。重组质粒可在转染的神经细胞中表达人端粒酶逆转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白,通过观察绿色荧光蛋白的表达对转染效率和结果进行及时、快捷的观察。人端粒酶逆转录酶真核表达载体的构建成功为进一步建立永生化神经干细胞奠定了基础。 4.大鼠胎儿神经干细胞的永生化与检测 通过对转染重组质粒的NSCs的GFP表达观察,多潜能性鉴定,RT-PCR和Western-blot分析,神经球中CD133+细胞增殖和细胞周期分布的流式细胞仪分析表明: (1)未转染的大鼠胎儿NSCs在体外培养中最高传7代,冻存了4.0×107 cells,而转染了重组质粒以后,细胞传代数上升,最高传12代,冻存3.35×107 cells (2)在本试验中,转染了重组质粒pEGFP-N1-hTERT的大鼠胎儿NSCs仍具有干细胞的生长特性和多潜能性,即在体外传代培养中可形成神经球并增殖,经血清诱导液诱导分化为神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞。裸鼠致瘤性试验证明了该细胞系无致瘤性。 (3)通过RT-PCR试验证明了转染重组质粒的大鼠胎儿NSCs中,存在hTERT基因mRNA的转录产物;荧光显微镜检查结合Western-blot试验证实了融合蛋白hTERT-GFP的表达。 (4)通过流式细胞仪分析未转染和转染重组质粒大鼠胎儿NSCs神经球中CD133+细胞增殖情况和不同时间细胞周期的变化,进一步证实了该重组质粒对神经干细胞端粒酶活性有上调作用,可促进细胞的体外长期增殖。


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