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山羊精原干细胞体外培养体系的建立与移植研究

阿拉达尔  
【摘要】: 精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是成年雄性动物体内唯一能进行终生自我更新,并且遗传亲代基因给予子代的一类二倍体永生细胞群,精原干细胞既有胚胎干细胞的发育特性又能发育成单倍体生殖细胞,也可以进行基因修饰后,将外源基因转移给后代。所以精原干细胞可以成为体外操作理想的干细胞群体。十年来小鼠精原干细胞培养和移植探索的不断完善,为各种哺乳动物及人类精原干细胞培养体系的建立和移植实验提供了新的思路和技术平台。本实验主要对山羊精原干细胞群体的富集、培养以及移植做了初步探索,结果如下: 1.对2~3月龄的山羊睾丸做切片观察,发现曲细精管中细胞形态比较单一,生精上皮还没有进入生精周期,通过免疫组化染色发现在曲细精管基底膜有大量PGP9.5+精原干细胞。适合做精原干细胞体外培养的供体来源。采用两步酶消化法,0.1%胶原酶和0.1%透明质酸酶消化20 min,0.25%胰酶+0.04% EDTA+5μg/mL DNaseⅠ处理5 min,就可以使睾丸生殖细胞充分分离处出来,每克睾丸组织克获得8.4±2.6×106个细胞,其中PGP9.5+精原细胞占(19.7±5.3)%,c-kit+精原细胞占总数的(23.8±3.6)%。 2.为了提高纯化方法富集PGP9.5+细胞的效率,本试验对比了Percoll法、差速贴壁法和盘化法。通过收集27~35%Percoll梯度间的细胞或盘化法纯化后,回收精原细胞纯度(包括PGP9.5+和c-kit+细胞)均达到82%以上,其中PGP9.5+细胞分别占(63.6±3.2)%和(71.9±4.1)%,而c-kit+分别占(21.2±1.8)%和(11.5±0.8)%。而差速贴壁法回收的精原细胞纯度可达60%左右,但其中c-kit阳性细胞所占比例较大。这三种方法中盘化法回收细胞的活力最高。 3.对山羊精原细胞体外培养生长行为进行了研究。将组织消化后的细胞在不添加生长因子和没有饲养层的情况下建立支持细胞和精原细胞(SC-SSC)共培养体系。我们在血清浓度为2.5%的培养体系内,第7d观察到有精原细胞克隆形成。原代SC-SSC共培养体系精原细胞克隆分布不均匀,在培养得7~10d,培养皿周边长出许多鸟巢状集落。在培养皿中心也可看到贴附予铺展开得体细胞上增殖的细胞集落。但集落形态松散,细胞之间连接不紧密。传代后,生殖细胞增殖没有退化的速度快,随着精原细胞死亡和分化,数量逐渐减少,一般维持不过第3代。我们将盘化法纯化的细胞接种到分裂抑制的MEF饲养层上培养,细胞贴壁较快,2~3d时开始增殖,5~6d出现16细胞以上的小细胞簇。但不添加生长因子时细胞增殖速度比较缓慢,脱落死亡的细胞比增殖的细胞多,集落会慢慢消失。 4.本试验参考小鼠精原干细胞长期培养的方法加以改进,得到了较理想的山羊精原干细胞细胞培养体系。考虑到血清因素对干细胞增殖的影响和高浓度血清会加快体细胞增殖,我们没有采用文献中经常提到的10%FBS,而是采用了2.5%的FBS,并且在培养体系内添加GDNF、LIF和bFGF后,明显促进了山羊精原干细胞增殖,对精原细胞克隆形态的维持和体积的增大都有促进作用。GDNF对精原干细胞增殖的影响与剂量有关,高剂量的GDNF更有利于细胞增殖和克隆体积的增大。而LIF对山羊精原细胞增殖并无显著影响,但在干细胞克隆形态的维持上起到较好的作用。GDNF和bFGF联合使用时加快了精原细胞增殖和克隆的数量,提示在体外培养时,GDNF和bFGF协同作用,可以提高精原干细胞增殖小生境的数量。我们在2.5%FBS,和添加100ng/mL GDNF、10ng/mL LIF和10ng/mL bFGF结合MEF饲养层的培养体系下使山羊精原干细胞在体外至少培养了三个月。 5.本试验对新鲜分离的山羊精原细胞进行了异种移植实验。首先我们采用没有经过免疫抑制的昆白鼠做为受体动物。40mg/kg体重的白消安处理,对受体小鼠的生精能力破坏最大,处理后4~6周可作为无内源性生殖干细胞的受体,用于精原细胞的异种移植。白消安对生精能力的破坏是可以恢复的,大概在注射后10周左右,有内源生殖细胞开始增殖。采用曲细精管注射的方法使小鼠睾丸充盈率达到50%左右。供体山羊精原细胞经过PKH26红色荧光染料染色后,在荧光显微镜下可以与小鼠睾丸的内源生殖细胞区分开。并且PKH26可以随着细胞分裂,转移到子代细胞中。所以可以在一段时间内在体内追踪到目的细胞。山羊精原细胞移植到小鼠曲细精管后,可以附着在曲细精管基膜上,进行增殖,但移植后一个月左右,外源细胞明显减少。通过组织切片观察到小鼠自身生殖细胞开始增殖。可能是由于内源性细胞增殖后对外源山羊精原细胞产生了排斥。 6.本试验对屠宰场收集到的不同体积的山羊睾丸进行了注射实验,为将来活体同种移植山羊精原干细胞建立有效的移植方法。由于山羊睾丸与小鼠睾丸解剖学上的不同,对小鼠睾丸的采取的曲细精管注射法和输出管注射法,在山羊上是不可取的。所以我们对山羊睾丸网进行注射实验,并且对注射部位进行了比较。结果显示外睾丸网注射法比内睾丸网注射法成功率要高,曲细精管充盈率也相对较高。超声波介导的的注射方法与徒手注射进行比较,二者对体积大的睾丸注射成功率相同,对小体积(8~25cm3)的睾丸采用徒手注射成功率更高一些。


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