抗病无核葡萄胚挽救育种及种质创新

【摘要】： 无核葡萄无论用于鲜食和制干,深受全世界消费者的青睐,由于无核葡萄的胚受精后通常在发育过程中败育,传统的育种方法通常只能采用“有核×无核”方式进行杂交,选育一个品种至少需要10年时间。目前借助胚挽救技术,可以直接采用无核葡萄作母本,可缩短育种周期1个世代并能有效提高后代无核百分率。由于欧洲葡萄多数不抗真菌病害,为了培育抗病、优质的无核葡萄新品种,国外借助胚挽救技术将圆叶葡萄的抗病基因渗入感病的无核品种的研究已有报道,但亚属间染色体组的差异(圆叶葡萄2n=40;欧洲葡萄2n=38)导致的杂交不亲和极大地限制了育种效率的提高。我国是葡萄属植物的重要原产地之一,拥有丰富的抗病种质资源,与欧亚种葡萄进行杂交容易亲和。因此,开发和利用这些材料中优异的抗病基因,借助胚挽救技术结合欧洲葡萄中的无核与优良品质基因,是进行抗病无核葡萄育种和种质创新的一条有效途径。 本研究主要以种子败育型无核葡萄和抗病性强的中国野生葡萄及其杂种进行杂交,对14个人工杂交、4个自交和2个自然授粉(共计20个组合)的材料胚挽救育种全过程及其影响因子进行了比较系统地研究,获得了比较适宜的培养基类型和育种效率的极大提高。在此基础上,进一步优化了集田间杂交、胚挽救技术和分子标记辅助选择于一体的抗病无核葡萄高效育种技术体系中各项技术参数,目前该技术体系应用于在“无核×抗病”杂交组合中,胚挽救成苗率最高可达65%以上。取得的主要研究结果如下: 1.通过研究不同亲本杂交组合对胚挽救的影响,认为母本品种的可挽救性对胚挽救成败起着决定作用,无核品种中“底来特”、“爱莫无核”、“红宝石无核”是非常优良的母本材料;而“无核紫”、“无核白”、“杨格尔”成苗率较低,不宜用作母本;父本品种对胚挽救效率也有一定影响,在以“红宝石无核”作母本时,“紫霞”作父本明显优于“新郁”;“火焰无核”自交成苗率出现下降,可能与母本基因型有关。 2.通过研究胚珠内胚培养阶段基本培养基类型、培养基形态、pH值、碳源、半胱氨酸、水解酪蛋白以及活性炭对胚挽救的影响,初步认为胚珠培养阶段以ER固-液双相培养基胚挽救效果最佳,显著优于NN和MS培养基;培养基pH值在5.0-7.0之间对胚的发育和成苗并无显著影响;培养基碳源以蔗糖效果最好,显著优于葡萄糖和果糖;半胱氨酸浓度不宜过高,以1.0 mmol l-1培养效果最佳;水解酪蛋白以500 mg l-1为宜;添加活性炭的用量则以1.5 g l-1为宜。在此基础上,结合矿质元素用量和配比的调整,提出了一种适于抗病无核葡萄育种的新型改良培养基配方(MM4,专利申请号200610043024.0)。 3.通过研究改良培养基(MM4)中微量元素、氨基酸、植物生长调节物质和抗氧化物质等不同添加物对胚挽救的影响,认为胚珠内胚培养阶段培养基添加物的作用在不同组合间存在差异。对于“无核×抗病”的杂交组合而言,选择10.0μmol l-1的微量元素锌胚挽救效果优于0.5μmol l-1的硒;氨基酸类物质以添加2.0mmol l-1甘氨酸或谷氨酰胺为宜;植物生长调节物质以选择较低浓度的ABA(0.01μmol l-1)为宜;培养基中添加100 mmol l-1甘露醇,对胚的发育和成苗具有促进作用。其中,胚珠培养最适宜的培养基组分为MM4+0.01μmol l-1 ABA,在组合“底来特×北醇”上胚挽救成苗率最高可达65.3%。 4.通过对离体幼胚萌发成苗过程的观察,发现并非所有的胚萌发后都能成苗,畸形苗的形成数量主要受到杂交组合中母本品种基因型和培养基的影响,“红宝石无核”和“爱莫无核”比“底来特”和“00-3-1”容易形成畸形苗,畸形苗比例最高占萌发胚的22.3%;胚发育培养基中添加赤霉素、吲哚乙酸、腐胺等外源生长调节物质显著增加畸形苗数量,而添加一定比例的微量元素锌或硒可以减少畸形苗的发生;接种前进行一定时间的低温处理(4℃-20d)或在培养基中添加一定比例的微量元素锌,在促进胚发育的同时可以有效减少畸形苗的发生,提高成苗效率;不同胚萌发培养基对畸形苗比例也有影响,WPM+1.0μM 6-BA比1/2MS+0.5μmol l-1 IBA胚萌发率高,同时也容易发生畸形苗;胚珠内培养时间在8～12周之间对畸形苗百分率无显著影响。 5.通过使用化学物质体外处理,并结合胚挽救培养基和采样时期等技术参数的优化设置,提高了无核葡萄育种效率。使用10.0 mmol l-1的腐胺授粉后6周进行果面喷布,可有效延迟胚败育的发生。在组合“爱莫无核×北醇”上,结合采用MM4+10.0μmol l-1ZnSO4培养基进行胚珠内胚培养,成苗率最高可达44.7%。在此基础上,提出了“田间杂交—化学物质处理—胚挽救”相结合的育种思路。试验过程中还发现,多胚发生频率同时受到基因型和化学物质处理的影响,“底来特”比“00-3-1”容易形成多胚,使用1.0×104μmmol l-1的腐胺处理后,在ER培养基上组合“底来特×北醇”多胚胚珠百分率最高可达22.0%。 6.通过对胚挽救幼苗移栽技术的研究,提出了配套的温室移栽技术措施:用于移栽的适宜基质配比为珍珠岩:草炭:园土=4:1:1,用普通方法移栽成活率可达90%;移栽之前需要对基质进行高压灭菌(121℃,30min);用于移栽的试管苗以离体培养40天效果最佳;移栽后采用1/16MS营养液连续浇灌盆栽效果较好;同时发现,有抗病亲本介入的组合杂种幼苗容易移栽成活。幼苗在温室内锻炼2-3个月,即可顺利进入大田。 7.通过对胚挽救获得的部分杂种后代的抗病无核性状进行了田间和分子生物学早期鉴定,认为中国野生葡萄中存在抗病的主效基因,与感病的欧洲无核葡萄杂交后可以遗传给后代,借助胚挽救技术可以创建无核抗病新材料;不同杂交组合F1代无核百分率表现为13.3~33.3%;组合“红无籽露×1-9-6”中抗病植株占检测后代总数的46.7%。从而有效地提高了抗病无核葡萄胚挽救育种效率,实现了无核葡萄的种质创新与遗传改良。