小麦条锈菌遗传转化体系的构建

【摘要】： 小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis West. f.sp tritici)引起的气流传播性病害,是世界各主要麦区,也是我国小麦上最重要的病害和主要监控研究对象。国内外研究和生产实践证明,种植抗锈良种是综合控制小麦条锈病最经济、有效、易行和对环境安全的核心措施。但是小麦条锈菌毒性变异频繁,可以通过变异产生新的毒性小种,导致小麦品种抗病基因失效,引起小麦条锈病周期性流行危害。因此,阐明小麦条锈病菌毒性变异的原因和规律,提出有效对策,以延长小麦品种使用寿命,是小麦条锈病防治和小麦育种中亟需解决的关键问题。小麦条锈菌主要是通过突变和异核作用产生致病性变异,病原菌突变体库的构建是对其进行分子遗传分析的重要手段,也是克隆致病相关基因的捷径。本研究探索了产生小麦条锈菌突变体的途径,建立了一套有效的条锈菌遗传转化体系,主要研究结果如下: 1.比较了电击转化,EMS化学诱变以及基因枪轰击产生条锈菌毒性突变体的效果,结果表明,电击转化不能有效的产生条锈菌毒性突变体,EMS化学诱变以及基因枪轰击均可有效的产生毒性变异,可以用来建立转化体系。 2.建立了化学诱导小麦条锈菌毒性突变的最佳体系:研究中发现诱变剂对处理当代条锈菌夏孢子的各项生物学特性有明显的削弱性影响,使其夏孢子存活力降低,致病力减弱和繁殖能力下降。不同处理时间和浓度的夏孢子萌发率经CurveExpert(1.3)MMF和Harris两个模型拟合的曲线为倒S型,表明小麦条锈菌夏孢子萌发率在EMS处理的浓度曲线和时间曲线上均有一个最适拟合系数,且夏孢子对低剂量EMS十分敏感。据此构建的EMS对小麦条锈菌毒性突变的最佳诱导体系为:室温下,pH=7.0,C=0.03mol/L,T=6-8min。小麦条锈菌夏孢子在此处理环境下的致死率在80%～90%之间,根据微生物诱变筛选最佳诱变剂量的选择标准,上述处理可作为小麦条锈菌化学诱变的主要参数。 3.建立并优化了小麦条锈菌基因枪法转化体系:影响基因枪转化率的因素很多,包括微弹的速度、射程、金粉用量、小麦条锈菌夏孢子的密度和水化时间、轰击时的氦气压,爆破膜承载压力,金粉颗粒的直径等多种因子。本实验研究表明在爆破膜承载压力为650、900Psi,爆破膜与承载膜之间的距离为2.5cm,承载膜与阻挡网之间的距离为0.8cm,阻挡网与靶细胞之间的距离为6cm,氦气压力2.7×104 Pa以及金粉颗粒直径为0.6μm时,萌发率较高但是转化率低,而在爆破膜承载压力为1100、1350和1550 Psi,爆破膜与承载膜之间的距离2.5cm,承载膜与阻挡网之间的距离为0.8cm,阻挡网与靶细胞之间的距离为6cm,氦气压2.7×104Pa以及金粉颗粒直径为0.6μm时,萌发率相对较低但是转化率较高。此外,在对小麦条锈菌转化体系的其它条件研究发现,每一枪锈菌用量0.2mg,金粉用量每枪500μg,质粒1μg,水化2h时所得转化率较高,以上结果作为基因枪转化小麦条锈菌的主要参数。 4.明确基因枪法转化条锈菌后报告基因的瞬时表达特点:以携带报告基因GUS基因的质粒(pGUS6L20)转化小麦条锈菌,随爆破膜承载压力增大GUS基因瞬时表达率逐渐升高,小麦条锈菌夏孢子在承载膜压力为1100、1350、1550psi下时均可瞬时表达。在1350psi和1550psi爆破膜承载压力下转化率相对较高可达到0.2%和0.34%,但是转化后的夏孢子萌发率只有25%左右。还发现x-gluc染色后,有些孢子颜色呈深蓝色,有些孢子则呈浅蓝色,表明在锈菌孢子中GUS的拷贝数和表达量有差别。以携带抗性基因hpt的质粒(pKLHyg14)转化条锈菌夏孢子,在爆破膜承载压力为650Psi、900Psi、1100Psi下,转化后的条锈菌夏孢子在含有50μg/ml潮霉素B的培养基上的萌发率都比对照有显著的提高,说明hpt抗性基因已在夏孢子中表达。因此报告基因GUS和抗性基因hpt均可作为条锈菌转化体的筛选标记。 5.筛选了具有不同毒性变异特点的小麦条锈菌CY17和CY31突变菌系:CY17有4个毒性突变菌系17M1～17M4:17M1中7个突变菌株都对早洋发生了无毒性突变;17M2对南大2419发生了毒性突变;17M3同时对南大2419和水源11都发生了毒性突变;17M4对阿勃、水源11也同时为毒性突变。CY31有3个毒性突变菌系31M1～31M3:31M1中5个菌株对尤二和T.E为毒性突变体、31F14-1对丹麦1号只为中感,而31MutS1是CY32; 31M2和31M3分别为两个无毒性突变体31C7-1和31C7-2,它们在繁殖一代时对其筛选品种中四有致病能力,但在繁殖3～4代后,其致病力丧失,且对大部分鉴别寄主的反应型也随着降低。表明了EMS的多位点诱变作用。聚类图表明各突变菌系与其原始菌株的相关系数都在85%以上,每个菌系中都有对不同品种发生多种微小突变的菌株,说明突变菌系与原始菌株既有一定的同源关系,又有微小的毒性变异区别,是化学诱变剂EMS诱导单点突变和逐步突变后的结果。而且CY17以无毒性突变体居多,CY31则以毒性突变体居多,表明诱导后的弱毒菌株多为无毒性突变,而强毒性小种则主要为毒性变异。 6.基因枪法转化条锈菌毒性突变体的获得及其生物学特性:以小麦条锈菌白化单孢菌系-5为转化受体,以分别含有GUS基因和潮霉素抗性基因(hpt)的质粒为载体,采用基因枪法转化小麦条锈菌。以携带报告基因GUS基因的质粒pGUS6L20转化小麦条锈菌后,在可裂膜为1350和1550Psi时,检测到GUS基因在其后代中表达;以携带抗性基因hpt的质粒pKLHyg14转化小麦条锈菌后,在可裂膜为1100Psi时,得到两个稳定的毒性突变菌株M1100-4-2、M1100-4-3。M1100-4-2菌株对南大2419的毒性减弱,反应型由野生菌系的4型变为2型;M1100-4-3菌株在南大2419的反应型由野生菌系的4型变为2 ,3型,毒性发生分化。采用中国鉴别寄主对突变体的毒性研究表明,各突变菌株的毒性均较原始菌系发生了明显改变。转化获得的突变体生物学特性发生了较大的变异,对多数筛选品种的毒性丧失,且潜育期延长。进一步用Hyg基因特异PCR在两个突变菌系中均扩增到目的片段,表明M1100-4-2、M1100-4-3的突变是由Hyg基因插入引起的。 本项目采用化学诱变法建立了小麦条锈菌毒性突变菌系,采用基因枪轰击导入外源基因标记,获得条锈菌致病性变异的突变体,建立了条锈菌致病性遗传研究新的技术体系,为条锈菌毒性基因的克隆和阐明条锈菌毒性变异的机理奠定了基础。