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辣椒与根结线虫不亲和互作相关基因的分离及功能分析

茆振川  
【摘要】: 根结线虫(Meloidogyne spp.)是辣椒主要病原物之一,每年造成巨大损失。Carolina Wonder (Capsicum annuum L.)和HDA149 (Capsicum annuum L.)为抗根结线虫的辣椒品种,分别含有单显性抗根结线虫基因N、Me3,抗南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)。通过SSH方法分析辣椒与根结线虫之间的不亲和互作可以初步的了解N基因和Me3基因介导的抗根结线虫机制,并分离抗性相关基因,对于辣椒抗根结线虫育种有重要意义。以Carolina Wonder和HDA149为试验材料,以接种南方根结线虫12、24、36 h的根尖材料作为测验方(tester),未接种根尖材料作为驱动方(driver),分别构建了N基因和Me3基因介导早期表达的抑制消减杂交cDNA文库,并结合文库高密度点阵膜杂交差异筛选,构建了相应的EST表达谱。 在N基因介导的表达基因谱中获得了237条表达序列标签(EST)片段。在GenBank上进行BLASTn与BLASTx分析,得到148条已知的EST序列,获得已知的上调抗性相关EST 68个。分离出了编码抗线虫蛋白和类LRR抗性蛋白的基因;与过敏性坏死反应和系统获得性抗性相关的类萌芽素(GLP)、HSR203J蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽、Kuntiz蛋白酶抑制剂等基因;多种信号蛋白基因,如ATP酶、钙结合蛋白、14-3-3蛋白、离子通道、水通道蛋白、渗透蛋白、泛素蛋白;以及与抗性相关的WRKY、乙烯转录因子(ERFBP)等转录因子的基因。 在Me3基因所介导的早期抗根结线虫基因表达库中,经过点阵膜杂交筛选到309个克隆为阳性表达。通过NCBI基因库BLASTn和BLASTx同源对比,共有229个可以找到已知的同源基因,其中71个为功能未知的基因。30个没有发现与其匹配的同源序列。将所得的已知的158个EST序进行功能分类,可知表达的抗根结线虫相关基因涉及抗病反应的全过程,包括与病原菌相互识别作用,防御相关基因的调控,信号转导,转录因子、代谢调控以及细胞组分等多个方面。分离到三个编码NBS-LRR结构的基因,H-40、H-634、H-614,分别与抗黄萎病(Verticillium dahliae)、BS2抗细菌(Xanthomonas campestris)、Mi-1抗根结线虫(Meloidogyne spp.)基因具有同源性,且相似度很高。同时分离出了WRKY转录因子、乙烯转录因子、MYB型转录因子,以及介导基因沉默的AGO1-2基因、介导过敏性坏死的Avr9/Cf-9快速激发蛋白、hin1蛋白等重要防御相关的基因。 通过根结线虫侵染组织的显微观察和消减文库中EST功能分类方法对所得基因在分子功能、细胞组成及生物过程等方面进行功能分类和分析,初步推断认为N基因,Me3基因介导的早期抗根结线虫作用具有相似的反应体系:具有NBS-LRR结构的蛋白识别线虫的入侵,激活抗性信号的传递,使WRKY、EREBP及非毒性基因快速激发蛋白等重要抗性相关反应因子的表达,使寄主植物的HR、SAR防御反应和保护机制适当地表达,并且,这些反应是基于寄主的初生代谢和次生代谢的调控体系。 通过消减杂交,在根结线虫诱导的Carolina wonder辣椒根尖中分离出了CaRKNIF (WRKY)、Ca-372(Snakin2)、CaERF基因,并通过RACE方法确定了这三个基因的全长。通过Southern和Northern杂交的方法确定了这些基因的部分特性。 Ca-372基因全长为707 bp,开放阅读框为315 bp,编码具有104氨基酸的小分子蛋白。这个基因编码蛋白与来自马铃薯(Solanum tuberosum)蛇毒素蛋白(Snakin2)具有同源性,确定相似度达到89% (93/104),而蛇毒素蛋白在马铃薯抵御逆境作用中起着重要作用。通过Southern和Northern杂交证实,在Carolina wonder辣椒中Ca-372是一个单拷贝基因,并且在接种根结线虫6 h时表达量明显增加,在48 h时达到最高。Ca-372分离自根结线虫诱导抗根结线虫辣椒表达的差显文库,所以推测Ca-372在抗根结线虫中起着一定作用。 CaRKNIF基因全长为2139 bp,开放阅读框为1473 bp,编码具有490氨基酸的蛋白,它与来自烟草的(Nicotiana tabacum)DNA绑定蛋白2(WRKY2)具有同源性,相似度达到68% (371/538),期望值达到1e-179,通过基因对比分析CaRKNIF属于WRKY家族,具有两个保守的WRKY区域。通过杂交证实,在Carolina wonder辣椒中CaRKNIF是一个单拷贝基因。在接种根结线虫6 h时CaRKNIF即可被诱导表达,12 h时强烈表达。 CaERF基因全长为1528 bp的全长基因,开放阅读框为1128 bp, CaERF编码375个氨基酸,CaERF的分子量为41.5 kd,具有一个由59个氨基酸构成的保守的ERF结构域(104-162),和一段可能作为核定位信号的富含K、R氨基酸的碱性结构域。属于乙烯反应因子家族的第Ⅳ次家族。Southern和Northern杂交证实,在HDA149辣椒中,CaERF是一个单拷贝基因,并且在接种根结线虫6 h时被强烈的诱导表达。 总之,试验采用SSH方法初步的探索了辣椒N基因和Me3基因的抗根结线虫机制,分离到许多抗性相关基因,同时对Ca-372、CaRKNIF、CaERF基因全长的分离及功能分析有助于进一步的认识并利用N基因和Me3基因对根结线虫的抗性奠定了良好的基础。在研究中分离出的许多抗根结线虫基因EST片段,以及在试验中发现的许多功能未知的基因,可能代表着新的抗根结线虫基因,有待于进一步的研究。


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