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西农萨能奶山羊乳腺cDNA文库构建和LPL基因的克隆与序列分析

韩雪峰  
【摘要】: 为了解山羊乳腺组织基因表达信息,进行乳腺比较基因组学、功能基因组学研究,并促进山羊奶膻味形成机理研究,本研究以西农萨能奶山羊为材料,构建泌乳中期乳腺组织的cDNA文库。文库质量鉴定后,从文库中挑选部分克隆进行测序分析,同时根据LPL基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR、5′-RACE方法并结合cDNA文库PCR扩增方法获得LPL基因全长cDNA序列,并对该序列进行生物信息学分析,利用实时定量PCR分析LPL基因在不同泌乳期乳腺的表达模式,取得如下结果: 1.利用质粒载体构建了西农萨能奶山羊泌乳中期乳腺组织cDNA文库,并对文库质量进行了鉴定。结果显示乳腺文库滴度为1.9x10~6cfu/mL,文库容量为1.4x10~7 cfu,重组率为96%,平均插入片段长度在1.1 kb以上,结果表明成功构建山羊乳腺组织cDNA文库; 2.从西农萨能奶山羊乳腺cDNA文库中随机挑取部分克隆进行5′EST单向测序,结果得到115个测序结果,测序成功率为89.8%。利用GenBank非冗余核苷酸数据库对所获得的115个ESTs序列进行了同源性分析,并对没有匹配的序列进一步在EST数库中进行了同源性比较。结果显示,在所测115个山羊乳腺组织ESTs中存在22个已知功能基因,另外有29个序列为未知EST序列。有5个山羊基因被鉴定出来,分别代表5类蛋白质,分别是:β-乳球蛋白,αs2-酪蛋白,前α-乳白蛋白,糖酰化依赖的细胞粘附分子-1和脂肪酸合酶。所测的115个ESTs序列已全部提交GenBank,并取得了序列的Accession No.; 3.通过RT-PCR方法克隆西农萨能奶山羊乳腺LPL基因编码区(Coding Sequence,CDS)和3′端非翻译区(3′-UTR)的1546-3064片段,利用5′-RACE方法扩增得到LPL基因5′端非翻译区(5′-UTR),利用cDNA文库扩增得到LPL基因3′末端,对上述片段进行序列拼接,得到西农萨能奶山羊乳腺LPL基因全长cDNA,cDNA序列全长为3630 bp,其中CDS区1437 bp,3′-UTR区1990 bp,5′-UTR区203 bp; 4.对西农萨能奶山羊LPL基因cDNA序列进行了生物信息学分析。CDS区全长1437bp,编码478个氨基酸,CDS区序列已登陆GenBank,注册号为:DQ997818。西农萨能奶山羊LPL基因CDS序列(DQ99781 8)与绵羊(NM_001009394)、牛(NM_001075120)、猪(AY559453)、人(NM_000237)和小鼠(NM_008509)相应区域核苷酸同源性分别为98%、98%、91%、89%和87%,氨基酸同源性分别为98%、98%、92%、90%和88%,在编码区88-102位较人、鼠LPL基因编码区比人和鼠多9个碱基,3个氨基酸,同时经过蛋白质功能域预测,西农萨能奶山羊LPL较人LPL多一个潜在功能基序。 5.用实时定量PCR方法检测西农萨能奶山羊LPL基因在泌乳前期、盛期、中期、后期及干奶期五个不同泌乳阶段的表达丰度,结果表明LPL基因在泌乳初期的表达丰度最高,其次是泌乳盛期和末期,在干奶期表达量最低。


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